miRNA-145對(duì)SHR動(dòng)脈VSMC的表型調(diào)控作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:miR-145在SHR動(dòng)脈VSMC中的表達(dá)及細(xì)胞表型測(cè)定
　　目的:(1)觀測(cè)miR-145在8、12、16、20周(W)齡SHR胸主動(dòng)脈VSMC中的表達(dá)的情況，并分別與相同周(W)齡Wistar大鼠相比較(2)檢測(cè)VSMC的細(xì)胞表型標(biāo)志α-SMA和SMemb在8、12、16、20W齡SHR胸主動(dòng)脈VSMC中的表達(dá)的情況，并與Wistar大鼠相比較:(3)分別測(cè)量8、12、16、20W末SHR和Wistar大鼠的動(dòng)脈收縮

2、壓(SAP)、動(dòng)脈舒張壓(DAP)和平均動(dòng)脈動(dòng)脈壓(MAP)，并相互比較;(4)測(cè)量8、12、16、20W末SHR和Wistar大鼠的胸主動(dòng)脈中膜厚度(MT)、中膜面積(WA)/內(nèi)腔面積(LA)百分比，并相互比較;(5)作不同周齡SHR miR-145相對(duì)表達(dá)量與對(duì)應(yīng)周齡的MT和SAP的相關(guān)性分析。
　　方法:Real-time PCR法檢測(cè)miR-145在不同周齡SHR和Wistar大鼠胸主動(dòng)脈VSMC中的表達(dá);Real-tim

3、e PCR法和Western-blot法檢測(cè)VSMC的表型標(biāo)志α-SMA和SMemb的mRNA和蛋白在SHR和Wistar大鼠胸主動(dòng)脈中的表達(dá)情況;ALC-NIBP無創(chuàng)血壓測(cè)量分析系統(tǒng)測(cè)量不同周齡SHR和Wistar大鼠的血壓;HE染色切片觀測(cè)胸SHR和Wistar大鼠的胸主動(dòng)脈VSMC的形態(tài)、中膜厚度(MT)、中膜面積(WA)/內(nèi)腔面積(LA)百分比。
　　結(jié)果:(1)SHR的miR-145的相對(duì)表達(dá)量明顯低于Wistar大鼠(

4、p＜0.05);隨SHR周齡的增加miR-145的相對(duì)表達(dá)量逐步下降(p＜0.05)，但16周后組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同周齡Wistar大鼠的miR-145的相對(duì)表達(dá)量無明顯差異(p＞0.05);
　　(2)SHR的α-SMA的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于Wistar大鼠(p＜0.05);而SMemb的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于Wistar大鼠(p＜0.05);隨SHR周齡的增加α-SMA的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量

5、逐步下降(p＜0.05)，而SMemb的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量逐步增加(p＜0.05)，但16周后組內(nèi)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同周齡Wistar大鼠的α-SMA和SMemb的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量無明顯差異(p＞0.05);
　　(3)SHR的SAP、DAP、MAP明顯高于Wistar大鼠(p＜0.05)且隨周齡增加逐步增高(p＜0.05)，16周后血壓增加達(dá)高峰，此后維持在這一高水平;Wistar大鼠血壓在正常范圍內(nèi)，不隨周

6、齡增加逐步增高;
　　(4)HE切片觀察，SHR主動(dòng)脈壁明顯比Wistar大鼠增厚，平滑肌細(xì)胞層增多，排列紊亂，彈力纖維明顯扭曲，且隨周齡增加，平滑肌細(xì)胞層也逐步增多;而Wistar大鼠各彈力纖維層排列整齊有序;
　　經(jīng)測(cè)量SHR的MT、WA/LA均比Wistar大鼠增加(p＜0.05)，且有隨周齡增長(zhǎng)而增加的趨勢(shì);不同周齡Wistar大鼠MT、WA/LA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);
　　(5)相關(guān)分析提示:SH

7、R的miR-145相對(duì)表達(dá)量與其血壓和MT呈明顯負(fù)相關(guān)(p＜0.01)。
　　結(jié)論:(1)miR-145在SHR和Wistar大鼠胸主動(dòng)脈VSMC中均有表達(dá);在Wistar大鼠中高表達(dá)，在SHR中明顯低表達(dá)，且隨SHR血壓升高表達(dá)有下降趨勢(shì);
　　(2)SHR和Wistar大鼠胸主動(dòng)脈VSMC表型不同;SHR胸主動(dòng)脈VSMC表型為合成型，Wistar大鼠胸主動(dòng)脈VSMC表型為收縮型;
　　(3)隨SHR血壓升高、MT增

8、厚，miR-145相對(duì)表達(dá)量下降。
　　第二部分:藥物干預(yù)對(duì)miR-145在SHR動(dòng)脈VSMC中表達(dá)及細(xì)胞表型的影響
　　目的:探討在藥物干預(yù)降低SHR血壓后，miR-145在SHR動(dòng)脈VSMC中表達(dá)是否受到影響，以及VSMC的表型是否發(fā)生改變？同時(shí)觀測(cè)與VSMC增殖相關(guān)的基因表達(dá)變化情況。
　　方法:16周齡雄性SHR30只隨機(jī)分為2組:對(duì)照組(SHRc組)和纈沙坦（Valsartan，代文）干預(yù)組（SHRv組）。S

9、HRv組給予30mg/kg/d纈沙坦灌服，SHRc組灌服同體積的生理鹽水。在干預(yù)0W、6W、12W末測(cè)定各組的SAP、DAP和MAP，并進(jìn)行比較;同時(shí)，Real-time PCR法檢測(cè)miR-145在SHRc組和SHRv組胸主動(dòng)脈VSMC中的表達(dá)差異;Real-time PCR法和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)VSMC的表型標(biāo)志α-SMA和SMemb的mRNA和蛋白在兩組間胸主動(dòng)脈中的表達(dá)情況;和VSMC增殖相關(guān)的基因p38MAPK和KLF-5的m

10、RNA和蛋白在兩組間表達(dá)差異;利用HE切片染色觀測(cè)兩組胸主動(dòng)脈VSMC的形態(tài)、中膜厚度(MT)、中膜面積(WA)/內(nèi)腔面積(LA)百分比的差異。
　　結(jié)果:(1)SHRv組SAP、DAP、MAP隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而逐步下降，one-way ANOVA顯示干預(yù)0W、6W和12W時(shí)兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=37.46，p=0.0000);SHRc組SAP、DAP、MAP不隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而減小，兩兩相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);

11、SHRv組血壓較對(duì)照組SHRc明顯降低(p＜0.05);
　　(2)SHRv組胸主動(dòng)脈VSMC中miR-145相對(duì)表達(dá)量隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)逐步增加，統(tǒng)計(jì)分析顯示干預(yù)0W、6W和12W時(shí)兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.13，p=0.0000)，SHRc組miR-145相對(duì)表達(dá)量不隨干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而增加;SHRv組miR-145相對(duì)表達(dá)量在干預(yù)0W、6W和12W末較對(duì)照組SHRc均明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);相關(guān)性分析

12、表明:隨SHRv組血壓下降，miR-145相對(duì)表達(dá)量逐步增加，兩者顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.8176）;
　　(3)SHRc組的α-SMA、SMemb、p38MAPK、及KLF-5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在各自不同的干預(yù)時(shí)間相比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.78, p=0.69; F=0.89, p=0.53; F=1.21, p=0.27; F=0.67, p=0.91);SHRc組的α-SMA、SMemb、p38MAPK、及KLF

13、-5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量在各自不同的干預(yù)時(shí)間相比較，one-way ANOVA顯示差異均統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.81，p=0.00; F=7.04，p=0.00; F=4.28，p=0.03; F=5.88，p=0.006); SHRc組的α-SMA mRNA的相對(duì)表達(dá)量隨纈沙坦干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而逐步增加，而其余幾個(gè)因子的mRNA的相對(duì)表達(dá)量都隨纈沙坦干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而逐步下降;各因子的蛋白表達(dá)量情況與mRNA的表達(dá)量相似;
　　(4)HE

14、切片觀察，SHRv組剛?cè)虢M時(shí)，見主動(dòng)脈明顯增厚和中膜彈力纖維增生，排列紊亂，彈力纖維明顯扭曲;隨血壓下降，SHRv組主動(dòng)脈增厚和中膜彈力纖維增生明顯減輕;而SHRc組在整個(gè)觀察期間主動(dòng)脈明顯增厚和中膜彈力纖維增生現(xiàn)象無改善;干預(yù)后SHRv與SHRc相比，中膜增厚、中膜面積/內(nèi)腔面積減少（p均＜0.05）。
　　結(jié)論:(1)血管緊張素Ⅱ(AT1)受體拮抗劑纈沙坦能降低SHR的SAP、DAP、MAP;
　　(2)隨SHR血壓下降

15、，SHR胸主動(dòng)脈VSMC的miR-145表達(dá)逐步增高;VSMC的細(xì)胞表型由合成型向收縮型轉(zhuǎn)換;
　　(3)隨血壓下降，SHR胸主動(dòng)脈VSMC的增殖減輕;VSMC增殖的相關(guān)因子表達(dá)減少。
　　第三部分:抑制和過表達(dá)miR-145改變SHR動(dòng)脈VSMC的表型
　　目的:進(jìn)一步探討miR-145在SHR動(dòng)脈VSMC的表型轉(zhuǎn)換中的作用，觀測(cè)轉(zhuǎn)染不同濃度miR-145 mimics和inhibitors對(duì)SHR動(dòng)脈VSMC的表型

16、的影響。
　　方法:取8周齡雄性SHR胸主動(dòng)脈，采用組織貼塊法體外培養(yǎng)VSMC，并用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行驗(yàn)證。采取傳代至6-8代VSMC進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)。利用lipofectamineTM2000將不同濃度(3nM、50 nM、100 nM)的miR-145 mimics和inhibitors分別轉(zhuǎn)入VSMC，繼續(xù)孵育24h后，Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同濃度miR-145 mimics和inhibitors后，α-SMA和

17、SMemb的mRNA在VSMC中的表達(dá)情況;MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同濃度miR-145 mimics和miR-145 inhibitors48h后VSMC的增殖情況。0結(jié)果:(1)采用組織貼塊法成功培養(yǎng)出VSMC，免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)VSMC陽性細(xì)胞的純度＞99％;
　　(2)轉(zhuǎn)染不同濃度miR-145mimics后，VSMC的α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性增高，方差分析顯示不同miR-145 mimics轉(zhuǎn)染濃度下，α-SM

18、A mRNA相對(duì)表達(dá)量增高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=36.63，p=0.00);100nM組miR-145mimics過表達(dá)使α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量是Mock組的4.71倍;
　　(3)轉(zhuǎn)染miR-145 mimics對(duì)VSMC的SMemb mRNA相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性降低，方差分析顯示不同miR-145 mimics轉(zhuǎn)染濃度下，SMemb mRNA相對(duì)表達(dá)量降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=14.84，p=0.02);100nM

19、miR-145 mimics組的SMemb mRNA相對(duì)表達(dá)量?jī)H是Mock組表達(dá)量的30.47％;
　　(4)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitors使VSMC的α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性降低，方差分析顯示不同miR-145 inhibitors轉(zhuǎn)染濃度下，α-SMA mRNA相對(duì)表達(dá)量降低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.06，p=0.00);100nM miR-145 inhibitors組的α-SMA mRNA相對(duì)

20、表達(dá)量?jī)H是Mock組表達(dá)量的26.48％;
　　(5)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitors對(duì)VSMC的SMemb mRNA相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性增高，方差分析顯示不同miR-145 inhibitors轉(zhuǎn)染濃度下，SMemb mRNA相對(duì)表達(dá)量增高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=17.29，p=0.03);100nM組miR-145 inhibitors過表達(dá)使SMemb mRNA相對(duì)表達(dá)量是Mock組的2.08倍;
　　(6)M

21、TT檢測(cè)顯示:50nM、100nM miR-145 mimics，分別使VSMC增殖活性減少27.6％±7.8％、67.4±9.3％，兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);而50nM、100 nM miR-145 inhibitors，分別使VSMC增殖活性增加了145.2％±11.2％、205.7±15.6％，兩兩相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論:(1)miR-145能調(diào)控VSMC細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換;抑制miR-1

22、45表達(dá)，使VSMC表型向合成型轉(zhuǎn)換;過表達(dá)miR-145，使VSMC表型向收縮型轉(zhuǎn)換;
　　(2)過表達(dá)miR-145能抑制VSMC增殖;抑制miR-145表達(dá)促進(jìn)VSMC增殖;
　　第四部分:miR-145通過p38MAPK信號(hào)通路調(diào)控VSMC表型轉(zhuǎn)換
　　目的:探討miR-145是否通過p38MAPK信號(hào)通路調(diào)控動(dòng)脈VSMC表型轉(zhuǎn)換。
　　方法:(1)過表達(dá)和抑制miR-145后，Real-time PCR

23、檢測(cè)p38MAPK與KLF-5的mRNA在VSMC中的表達(dá)情況;Western-blot檢測(cè)Myocardin和KLF-5的蛋白表達(dá)情況;(2)p38MAPK與KLF-5在VSMC表型轉(zhuǎn)換中的關(guān)系:VSMC按實(shí)驗(yàn)需要分為3組，正常對(duì)照組;AngⅡ誘導(dǎo)組;SB203580處理組。正常對(duì)照組為傳代至6-8代的VSMC; AngⅡ誘導(dǎo)組:加入AngⅡ終濃度為10-7M誘導(dǎo)后的VSMC;SB203580處理組為先加入終濃度為10-6M p38M

24、APK的抑制劑SB2035804h后，再加入AngⅡ終濃度為10-7的干預(yù)后VSMC。Real-time PCR檢測(cè)p38MAPK抑制劑SB203580對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)大鼠VSMC的α-SMA、SMemb mRNA表達(dá)的影響，同時(shí)Western-blot檢測(cè)p-p38MAPK和KLF-5的蛋白表達(dá)情況;MTT檢測(cè)VSMC增殖情況;
　　結(jié)果:(1)轉(zhuǎn)染miR-145 mimics后，VSMC的p38MAPK和KLF-5的mRNA相對(duì)

25、表達(dá)量呈濃度依賴性降低，方差分析顯示不同miR-145mimics轉(zhuǎn)染濃度下，p38MAPK和KLF-5mRNA相對(duì)表達(dá)量降低差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.19，p=0.00; F=38.70，p=0.00）;兩者高度正相關(guān);
　　(2)轉(zhuǎn)染miR-145 inhibitors后，VSMC的p38MAPK和KLF-5的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈濃度依賴性增加，方差分析顯示不同miR-145inhibitors轉(zhuǎn)染濃度下，p38MAPK和

26、KLF-5mRNA相對(duì)表達(dá)量增加差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=13.77，p=0.00;F=7.16，p=0.02）;兩者高度正相關(guān);
　　(3)MTT檢測(cè)顯示:與對(duì)照組相比，AngⅡ誘導(dǎo)組使VSMC增殖活性增加了236.3％±13.6％，而SB203580處理組與對(duì)照組相比VSMC增殖活性增加120.7±5.4％。AngⅡ誘導(dǎo)組與對(duì)照組、SB203580處理組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);但對(duì)照組與SB203580處理組相比

27、差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);
　　(4)與對(duì)照組相比，AngⅡ誘導(dǎo)組α-SMA的mRNA表達(dá)明顯減少，為對(duì)照組的0.37±0.04倍，而SMemb mRNA的mRNA表達(dá)卻明顯增加，為對(duì)照組的3.27±0.68倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);與對(duì)照組相比，SB203580處理組α-SMA的和SMemb mRNA的表達(dá)相差不大，分別為對(duì)照組的1.12±0.06倍和1.23±0.12倍，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)。

28、
　　(5) Western-blot結(jié)果顯示:AngⅡ能誘導(dǎo)p-p38MAPK和KLF-5的蛋白表達(dá)，且與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);給予p-38MAPK抑制劑后，p-p38MAPK和KLF-5的蛋白表達(dá)均明顯減少，與對(duì)照組及AngⅡ誘導(dǎo)組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05);
　　(6)過表達(dá)和抑制miR-145對(duì)KLF-5、p-p38MAPK和Myocardin的蛋白表達(dá)均有影響;Western

29、-blot結(jié)果顯示:Myocardin、KLF-5和p-p38MAPK的蛋白表達(dá)，在對(duì)照組及miR-145 inhibitors組和miR-145 mimics組兩兩相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。p-p38MAPK和KLF-5蛋白的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān);而KLF-5和Myocardin蛋白的表達(dá)顯著負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:(1) miR-145通過p38MAPK信號(hào)通路調(diào)控動(dòng)脈VSMC表型轉(zhuǎn)換;
　　(2)在p38MAPK信