miR-145對VSMC表型轉化和增殖的影響及機制探討.pdf

1、第一部分大鼠miR-145慢病毒表達載體的構建及鑒定
　　 目的：
　　 構建針對rno-miR-145的慢病毒表達載體并鑒定其在血管平滑肌細胞(VSMC)中是否過表達。
　　 方法：
　　 人工合成含有酶切位點粘端miR-145 shDNA雙鏈模板序列，克隆于LV3pGLV/H1/GFP+Puro-miRNA慢病毒穿梭載體中，轉染293FT細胞，收獲并濃縮慢病毒顆粒，同時構建無關序列陰性對照載體(Scr

2、amble-NC)。采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠原代VSMC，并將細胞分為3組：正常對照組、miR-145組、miR-NC組。倒置熒光顯微鏡下觀察VSMC感染后的熒光表達情況，Real-time PCR檢測各組miR-145的表達情況。
　　 結果：
　　 (1)成功構建了miR-145慢病毒載體，測定病毒滴度為1×109TU/ml。
　　 (2)倒置熒光顯微鏡下觀察大鼠microRNA-145慢病毒表達載體感染

3、成功，MOI值為50，感染72h時感染率最高。
　　 (3)Real-time PCR結果顯示構建的miR-145過表達慢病毒載體在感染目的細胞72小時后較空白細胞或陰性對照細胞表達豐度增加72.50倍(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 (1)建立了高效穩(wěn)定表達rno-miR-145的慢病毒轉染系統(tǒng)。
　　 (2)miR-145慢病毒載體感染VSMC后可高效的過表達，從而為進一步研究miR-145在大

4、鼠VSMC中的作用提供理論依據(jù)。
　　 第二部分miR-145對VSMC表型轉化及增殖的影響
　　 目的：
　　 miR-145慢病毒載體感染大鼠原代VSMC，PDGF-BB誘導VSMC表型轉化及增殖，選擇3個VSMC表型標志基因PCNA、c-Jun及SM22a，觀察miR-145對VSMC表型轉化和增殖是否有抑制作用。
　　 方法：
　　 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠原代VSMC，加入PDGF(

5、10ng/ml)誘導VSMC發(fā)生表型轉化，使VSMC轉化為去分化型（即獲得增殖能力），并將細胞分為4組：正常對照組、PDGF-BB(10ng/ml)組、PDGF-BB(10ng/ml)+miR-145組及miR-NC組。CCK-8法檢測各組細胞的增殖情況；實時RT-PCR方法檢測miR-145過表達后對PCNA、c-Jun及SM22a mRNA水平的影響；Western印跡方法檢測miR-145過表達后對VSMC表型轉化標志基因蛋白水平

6、的影響。
　　 結果：
　　 CCK-8結果顯示：與空白對照組相比，miR-NC組OD值無顯著差異(P＞0.05)；PDGF組OD值明顯升高(P＜0.01)；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+miR-145組OD值明顯下降(P＜0.05)。RT-PCR結果顯示：與空白對照組比較，miR-NC組PCNA、c-Jun及SM22a mRNA的表達無顯著差異(P＞0.05)；PDGF組PCNA、c-Jun mRNA的表達分

7、別上調37％(P＜0.05)和168％(P＜0.01)，而SM22a mRNA的表達下調80％(P＜0.01)；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+miR-145組PCNA、c-Jun mRNA的表達分別下調66％和77％(P＜0.01)，而SM22a mRNA的表達上調335％(P＜0.01)。Western-blot結果顯示：與空白對照組比較，PDGF組PCNA、c-Jun mRNA的表達明顯上調(P＜0.01)，而SM22a

8、mRNA的表達明顯下調(P＜0.01)；與PDGF-BB組比較，PDGF-BB+miR-145組c-Jun、PCNA mRNA的表達明顯下調(P＜0.01)，而SM22a mRNA的表達明顯上調(P＜0.01)。
　　 結論：
　　 1.miR-145可抑制PDGF誘導的VSMC增殖；
　　 2.miR-145可上調VSMC分化相關基因而下調增殖相關基因的表達，從而抑制VSMC的表型轉化。
　　 第三部分

9、miR-145通過MAPK信號轉導通路抑制VSMC增殖
　　 目的：
　　 選擇絲裂原活化蛋白激酶信號系統(tǒng)(MAPKs)家族的3個亞類：ERK1/2、JNK/SAPK、p38MAPK，探討miR-145過表達對PDGF-BB誘導的p-ERK/ERK、p-JNK/JNK及p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達的影響，進一步分析miR-145是否通過MAPK信號轉導途徑抑制VSMC增殖。
　　 方法：
　　

10、 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)SD大鼠原代VSMC，加入PDGF(10ng/ml)誘導VSMC發(fā)生表型轉化（即獲得增殖能力），并將細胞分為4組：正常對照組、miR-NC組、PDGF-BB(10ng/ml)+miR-145組及PDGF-BB(10ng/ml)組。Western印跡方法檢測ERK1/2和p-ERK1/2的表達、JNK和p-JNK的表達以及p38MAPK和p-p38MAPK的表達。
　　 結果：
　　 Western

11、-blot結果顯示：PDGF-BB(10ng/ml)誘導VSMC后，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK水平明顯上調，與空白對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。轉染miR-145干預72h后再加入PDGF-BB刺激，p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK水平明顯下調，與PDGF組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)?？召|粒組與空白對照組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論：
　　 miR-14