胰島素介導(dǎo)SHR VSMC增殖的基因外修飾機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景： 大量研究證實(shí)高血壓合并糖尿病及高胰島素血癥的病人，發(fā)生心腦血管并發(fā)癥的風(fēng)險大大高于單純高血壓病人，動物實(shí)驗(yàn)與基礎(chǔ)研究證實(shí)：1、胰島素可誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動物動脈硬化的發(fā)生；2、在超生理濃度下，胰島素刺激血管平滑肌細(xì)胞的增生和遷移；3、長期給與外源胰島素導(dǎo)致脂異常與動脈壁增厚；4、胰島素輸注加速了輸注動脈的粥樣硬化。提示胰島素抵抗及其代償性的高胰島素血癥是冠心病的重要危險因素，在冠心病和血管增生性疾病的預(yù)防和治療過程中也說明

2、高胰島素血癥在血管增生性病變中發(fā)生重要作用。積極改善胰島素抵抗和高胰島素血癥，對以上的疾病將起到積極的防治作用。 二、研究目的： 明確結(jié)構(gòu)基因外修飾對血管平滑肌細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)換的影響，找出胰島素介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞異常增殖時基因外改變(結(jié)構(gòu)基因外修飾)調(diào)控細(xì)胞增殖的變化規(guī)律及結(jié)構(gòu)基因外修飾和細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)差異之間的內(nèi)在聯(lián)系及作用機(jī)制，揭示血管平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制，為血管增生性疾病的防治尋求新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

3、 三、研究內(nèi)容： 1.胰島素促SHR VSMCs增殖的MAPK機(jī)制。 2.丁酸鈉阻斷HDAC后組蛋白超乙?；瘜HR VSMCs增殖的影響。 3.胰島素對組蛋白乙酰化的影響，PD98059阻斷MAPK通路后組蛋白乙酰化的改變。 4.胰島素對HDAC1的作用及PD98059阻斷MAPK后對這種作用的影響。 5.丁酸鈉導(dǎo)致的組蛋白超乙?；瘜APK通路的影響。 6.胰島素對增殖相關(guān)因子PDG

4、F基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的影響及PD98059和丁酸鈉對胰島素的這種作用的影響。 7.胰島素對VSMCs表型相關(guān)蛋白質(zhì)α-SM actin、OPN表達(dá)的影響及PD98059和丁酸鈉對其的作用。 8.胰島素、PD98059、丁酸鈉對PDGF和α-SM actin DNA啟動子甲基化的影響。 四、研究方法： 1.原代培養(yǎng)SHR VSMCs。 2.H3-TdR摻入、MTT法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法、流式細(xì)胞儀檢測VSM

5、Cs的增殖情況。 3.建立胰島素促VSMCs增殖的濃度曲線。 4.以胰島素及PD98059干預(yù)VSMC后觀察VSMCs增殖的情況，免疫印跡和RT-PCR觀察MAPK蛋白質(zhì)表達(dá)及mRNA表達(dá)的變化。 5.丁酸鈉干預(yù)VSMCs后對胰島素促VSMC增殖作用的影響。 6.免疫印跡檢測胰島素、PD98059、丁酸鈉對VSMCs HDAC1及組蛋白乙酰化的影響。 7.免疫印跡檢測胰島素、PD98059、丁酸鈉

6、對MAPK表達(dá)的影響，RT-PCR檢測其對MAPK基因轉(zhuǎn)錄的作用。 8.免疫印跡檢測胰島素、PD98059、丁酸鈉對PDGF和α-SM actin表達(dá)的影響，RT-PCR檢測其對PDGF和α-SM actin基因轉(zhuǎn)錄的作用。 9.特異性甲基化DNA PCR檢測胰島素、PD98059、丁酸鈉對PDGF和α-SM actinDNA啟動子甲基化的影響。 五、研究結(jié)果： 1.胰島素能夠明顯促進(jìn)MAPK的表達(dá)及SH

7、R VSMCs增殖，且這種作用能被PD98059阻斷。 2.丁酸鈉能抑制胰島素促進(jìn)SHR VSMCs增殖的作用。 3.胰島素促進(jìn)HDAC1的表達(dá)，丁酸鈉明顯抑制HDAC1的表達(dá)，PD98059對HDAC1的表達(dá)無明顯影響。 4.免疫印跡顯示胰島素促進(jìn)組蛋白H3乙酰化，而PD98059抑制胰島素的這種作用。 5.胰島素上調(diào)PDGF的表達(dá)，同時下調(diào)α-SM actin的表達(dá)。該作用可被PD98059和丁酸鈉阻

8、斷。 6.胰島素促進(jìn)MAPK、PDGF基因的轉(zhuǎn)錄，同時抑制α-SM actin基因的轉(zhuǎn)錄，該作用可被PD98059和丁酸鈉阻斷。 7.PDGF DNA啟動子在SHR VSMCs中生理情況下處于非甲基化狀態(tài)，胰島素、PD98059對其非甲基化狀態(tài)沒有影響，但丁酸鈉可以使PDGF DNA啟動子發(fā)生甲基化。 8.α-SM actin DNA啟動子在SHR VSMCs中生理情況下處于非甲基化狀態(tài)，胰島素、PD98059、