胰島素對大鼠vsmc增殖及下調(diào)AP-1抑制血管平滑肌α肌動蛋白表達(dá)的研究.pdf

1、目的：
　　我國大約有4085萬人是糖尿病患者，其人數(shù)已經(jīng)位居世界第二。隨著生活水平的改善及提高，糖尿病的發(fā)病率也隨之上升。為此，人類的身體及心理健康遭到了嚴(yán)重的危害。當(dāng)患者被診斷為糖尿病時，常發(fā)現(xiàn)已經(jīng)并存了血管并發(fā)癥，特別是動脈粥樣硬化性心、腦血管病。近來，大量臨床研究資料及糖尿病血管并發(fā)癥的研究表明，糖尿病患者比非糖尿病患者更能合并動脈粥樣硬化。與此同時，胰島素抵抗更多地見于血管發(fā)生了動脈粥樣硬化的糖尿病患者。
　　胰島

2、素抵抗表現(xiàn)為體內(nèi)各組織或細(xì)胞對胰島素的反應(yīng)遲鈍，即其敏感性不足或消失，機(jī)體中組織或細(xì)胞出現(xiàn)胰島素抵抗，繼而與胰島素相關(guān)的一些生物作用降低，最終會引起血液中胰島素濃度代償性地增高，出現(xiàn)高胰島素血癥。所以，高胰島素血癥可以作為胰島素抵抗的一個重要標(biāo)志。許多臨床研究顯示，當(dāng)糖尿病患者的血管發(fā)生了粥樣斑塊時，其血液中胰島素的濃度往往處于較高水甲。以上這些都說明了，當(dāng)糖尿病患者合并了動脈粥樣硬化時，胰島素抵抗及后續(xù)引起的高胰島素血癥是其重要的高危

3、因素。
　　2型糖尿病患者的血管性疾病有很多，其中包括血管內(nèi)粥樣斑塊的形成及血管再通后的再狹窄等。多項研究發(fā)現(xiàn)，這些血管性疾病的病理過程都相同，即血管平滑肌細(xì)胞（Vascular smooth muscle cell，VSMC）發(fā)生表型轉(zhuǎn)換。當(dāng)VSMC的表型發(fā)生轉(zhuǎn)換后（由分化的靜止表型向去分化的合成表型轉(zhuǎn)換），其正常生理功能發(fā)生改變，即出現(xiàn)增強(qiáng)的增殖、遷移能力以及紊亂的收縮舒張功能。目前，在對血管增生性疾病的發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制中，

4、VSMC表型轉(zhuǎn)換以及高胰島素血癥對VSMC影響的分子機(jī)制研究也成為了現(xiàn)今研究的熱點。
　　作為VSMC表型的標(biāo)志性蛋白:α肌動蛋白（smooth muscle alpha-actin，SM-α）在靜止收縮表型VSMC中大量表達(dá)，然而在胰島素刺激VSMC發(fā)生異常遷移及增殖時，VSMC內(nèi)的SM-α量大量減少，進(jìn)而VSMC從分化的靜止表型向去分化的合成表型轉(zhuǎn)換，最終導(dǎo)致了VSMC增殖及遷移能力的增強(qiáng)。因此，胰島素誘導(dǎo)VSMC中的關(guān)鍵分子

5、SM-α基因表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，最終促使VSMC生物學(xué)功能異常，其在血管動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。
　　激活蛋白1(Activator protein1，AP-1)作為細(xì)胞內(nèi)的一個轉(zhuǎn)錄因子能結(jié)合多個基因啟動子調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來應(yīng)對多種刺激，控制了許多的細(xì)胞進(jìn)程，包括增殖、分化及凋亡等。AP-1也能結(jié)合SM-α基因上游的特異啟動子序列從而發(fā)揮一系列生物效應(yīng)。然而AP-1在胰島素誘導(dǎo)SM-α基因表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致V

6、SMC表型轉(zhuǎn)換過程中的具體機(jī)制尚不是十分清楚。因此，明確胰島素對VSMC表型轉(zhuǎn)換及其增殖遷移效應(yīng)的影響機(jī)制對研究糖尿病患者血管并發(fā)癥等疾病發(fā)生發(fā)展具有重要的臨床意義。
　　方法：
　　1、體外培養(yǎng)SD大鼠VSMC
　　2、不同濃度的胰島素（0、25、50、100、125 nmol/L）刺激SD大鼠VSMC培養(yǎng)24h后，用流式細(xì)胞儀測VSMC的細(xì)胞周期。
　　3、設(shè)計并構(gòu)建AP-1表達(dá)質(zhì)粒后轉(zhuǎn)染到SD大鼠VSMC培

7、養(yǎng)24h，同時分成4個組:空白對照組;單純胰島素刺激組;AP-1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組;胰島素刺激+AP-1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。
　　4、用RT-PCR檢測4個實驗組中SD大鼠VSMC的SM-α、AP-1基因的mRNA表達(dá)水平
　　5、用Western blot檢測4個實驗組中SD大鼠VSMC的SM-α、AP-1基因的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、SD大鼠VSMC在靜止培養(yǎng)24小時后，加入不同濃度的胰島素刺激培養(yǎng)的VS

8、MC24小時，流式細(xì)胞檢測VSMC周期。結(jié)果顯示隨著胰島素濃度的增高，VSMC在培養(yǎng)24h后，其S期的百分比逐漸升高到一定峰值后開始下降[(23.49±1.17)％、(28.08±0.68)％、(30.44±1.77)％、(47.47±0.88)％、(46.23±1.65)％,P＜0.05]，VSMC在100nmol/L濃度胰島素刺激下S期百分比達(dá)到峰值(47.47±0.88)％。
　　2、SD大鼠VSMC在靜止培養(yǎng)24小時后，加

9、入100nM胰島素刺激培養(yǎng)的VSMC24小時，RT-PCR及Western blot檢測VSMC中AP-1及SM-α的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，胰島素刺激組AP-1[(0.47±0.09)、(0.46±0.14)]及SM-α[(0.41±0.03)、(0.32±0.03)]的mRNA及蛋白水平均低于對照組（未加胰島素刺激組）(P＜0.05)。
　　3、將構(gòu)建的AP-1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SD大鼠VSMC后，可上調(diào)SM-α基因(2

10、.25±0.28)的mRNA表達(dá)(P＜0.05)，同時在胰島素刺激下其AP-1基因的mRNA表達(dá)下調(diào)(0.99±0.20)且SM-α基因的mRNA表達(dá)(1.32±0.15)也同時受到抑制(P＜0.05)。
　　4、將構(gòu)建的AP-1表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SD大鼠VSMC后，VSMC中的SM-α基因(1.61±0.23)的蛋白表達(dá)升高(P＜0.05)。此外，VSMC中的AP-1基因(0.97±0.06)及SM-α基因(1.02±0.80)在胰