吡格列酮抑制模擬胰島素抵抗培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景及研究目的： 血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecells，VSMCs)的異常增殖是高血壓、糖尿病血管病變以及血管增生性疾病共同的病理結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。調(diào)控VSMCs增殖的神經(jīng)、體液因素眾多，其中胰島素抵抗(insulinresistance，IR)是重要原因之一。IR表現(xiàn)為胰島素(insulin，INS)的主要靶組織對INS的敏感性降低，VSMCs由收縮型向合成型(增殖)轉(zhuǎn)變；外周組織尤其是肌肉、脂肪組織

2、對葡萄糖的利用障礙，血糖升高。機(jī)體長期高糖也可使INS含量增高，促進(jìn)有絲分裂，引起VSMCs增殖，導(dǎo)致血管壁加厚及血管舒張與收縮功能障礙。因此改善IR所致VSMCs異常增殖是逆轉(zhuǎn)血管病變及防治心腦血管疾病的根本措施。 INS與其受體結(jié)合后，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞內(nèi)，經(jīng)一系列酪氨酸磷酸化級聯(lián)放大反應(yīng)，產(chǎn)生代謝及非代謝方面的生物學(xué)效應(yīng)?，F(xiàn)已查明體內(nèi)主要存在兩條INS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，即RAS-MEK-MAPK和IRSx-PI3K-PKB-mTOR

3、途徑。 PD98059阻斷絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)，從而顯著抑制細(xì)胞生長和遷移。LY294002可特異性地抑制PI3K-PKB通路，抑制多種生長因子通過磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3kinase，PI3K)激活蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)導(dǎo)致的生物學(xué)效應(yīng)。NO是PI3K-PKB通路的下游信號，IR時(shí)PI3K-PKB信號

4、轉(zhuǎn)導(dǎo)異常，一氧化氮合酶(nitricoxidesynthase，NOS)活性下降，導(dǎo)致L-精氨酸(L-Arg)-NOS-NO通路障礙，NO生成減少。PKB另一下游信號哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)不僅對VSMCs的增殖起著十分關(guān)鍵的作用，還可調(diào)節(jié)胞內(nèi)糖攝取及糖轉(zhuǎn)運(yùn)。IR或高INS血癥時(shí)，有關(guān)細(xì)胞GLUT1及GLUT4表達(dá)與轉(zhuǎn)位的實(shí)驗(yàn)結(jié)果尚存爭議，但RAP可抑制INS介導(dǎo)的GLUT

5、1mRNA上調(diào)，提示GLUT1的蛋白表達(dá)可能通過PI3K-PKB-mTOR信號級聯(lián)反應(yīng)。 目前改善IR相關(guān)疾病癥狀的藥物較多，但逆轉(zhuǎn)其血管病變的藥物較少。噻唑烷二酮類(thiazolidinediones，TZDs)藥物吡格列酮(pioglitazone，PIO)等是人工合成的過氧化物增殖激活受體γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorsγ，PPARγ)激動(dòng)劑，主要用于2型糖尿病及心血

6、管疾病治療，增加INS敏感性，抑制VSMCs增殖。研究表明，PPARγ激動(dòng)劑對VSMCs的抗增殖活性主要由PI3K-PKB介導(dǎo)，還可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期而停留在G1期，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)p27kiP1表達(dá)。但是否直接影響mTOR信號分子發(fā)揮抗增殖作用值得探討。另有研究指出，PIO能增加細(xì)胞因子介導(dǎo)的iNOS表達(dá)，提高NO含量，促進(jìn)VSMCs凋亡，而PIO抑制VSMCs增殖的機(jī)制尚未完全明了。 本實(shí)驗(yàn)以高糖高INS模擬IR狀

7、態(tài)培養(yǎng)VSMCs，探討PIO對高糖高INS誘導(dǎo)VSMCs增殖的影響及其與NO的關(guān)系，并通過檢測GLUT1、GLUT4及mTOR的mRNA表達(dá)，深入探討PIO抗VSMCs增殖與影響糖代謝的機(jī)制，為尋找有效靶標(biāo)及抑制VSMCs增殖的藥物，從而更有效地防治IR所致血管病變提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1.細(xì)胞培養(yǎng) 采用組織貼塊法原代培養(yǎng)兔和人的胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，傳代細(xì)胞分別用含10％小牛血清的正常RPMI1640培養(yǎng)基和高

8、糖高INS模擬IR培養(yǎng)基(含100U·L-1INS和2.5×10-2mol·L-1葡萄糖的RPMI1640培養(yǎng)基)培養(yǎng)。 2.分組與給藥 兔VSMCs分別經(jīng)正常培養(yǎng)和模擬IR培養(yǎng)后，設(shè)定細(xì)胞對照、PIO(終濃度為10-smol·L-1)、PIO合用L-NAME(終濃度分別為10-5mol·L-1、10-4mol·L-1)、L-NAME(終濃度為10-4mol·L-1)給藥組。 人VSMCs分別經(jīng)正常培養(yǎng)和模擬IR

9、培養(yǎng)后，設(shè)定細(xì)胞對照組、PIO高低劑量組、PD98059組、PD98059+LY294002組、PD98059+LY294002+PA組；細(xì)胞經(jīng)PD98059以及PD98059+LY294002+PA處理后，分別給予RAP、PIO(高低劑量)干預(yù)。所加藥物的終濃度分別為PD98059(3×10-5mol·L-1)，PIO(10-4mol·L-1，10-5mol·L-1)，LY294002(10-smol·L-1)，PA(10-4mol·

10、L-1)，RAP(10-7mol·L-1)。 3.測定指標(biāo) 人與兔VSMCs經(jīng)不同給藥處理3d，用不含細(xì)胞的培養(yǎng)基空白孔調(diào)零，MTT法(λ=490nm)測定細(xì)胞增殖； 收集培養(yǎng)兔VSMCs上清，利用硝酸還原酶法按照NO測定試劑盒說明書測定NO含量； 收集兔VSMCs，用NOS試劑盒測定總NOS和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase，iNOS)活性； 利用Tr

11、izol試劑提取人VSMCs總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增GLUT1、GLUT4及mTOR目的條帶，PCR條件為94℃×4min，94℃×30sec，58.5℃×45sec，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，拍照，目的條帶進(jìn)行灰度掃描，計(jì)算相對含量。 結(jié)果： 在培養(yǎng)兔VSMCs實(shí)驗(yàn)中，PIO(10-5mol·L-1)對正常培養(yǎng)及模擬IR培養(yǎng)VSMCs均呈現(xiàn)抑制作用(P＜0.01，P＜0.01)，且在后

12、者中作用更強(qiáng)。L-NAME促進(jìn)正常及模擬IRVSMCs增殖，PIO能部分阻斷L-NAME對正常培養(yǎng)和模擬IR培養(yǎng)VSMCs增殖作用。模擬IR培養(yǎng)液中NO含量較正常培養(yǎng)液中低。PIO干預(yù)可使兩種培養(yǎng)方式的培養(yǎng)液中NO含量均增加(P＜0.01，P＜0.01)，且在模擬IR組作用更為顯著，加用L-NAME后該作用均減弱。單用L-NAME，兩種培養(yǎng)方式的培養(yǎng)液中NO含量均明顯減少。模擬IR培養(yǎng)VSMCs總NOS活性及iNOS活性均下降，PIO能

13、明顯增加正常培養(yǎng)及模擬IR培養(yǎng)VSMCs總NOS及iNOS活性，且在模擬IR培養(yǎng)時(shí)作用更顯著。L-NAME明顯抑制總NOS及iNOS活性，PIO能部分阻斷L-NAME的作用。 在培養(yǎng)人VSMCs實(shí)驗(yàn)中主要考察PD98059或PA干預(yù)后，PIO(10-4mol·L-1，10-5mol·L-1)對模擬IR培養(yǎng)細(xì)胞增殖及細(xì)胞GLUT1、GLUT4和mTORmRNA表達(dá)的影響。PD98059顯著抑制正常培養(yǎng)和模擬IR培養(yǎng)VSMCs增殖，

14、LY294002和RAP均增加此抑制作用。在細(xì)胞與PD98059共孵育時(shí)，兩種劑量的PIO均呈現(xiàn)抑制VSMCs增殖的作用(正常組：P＜0.01，P＜0.01；模擬IR組：P＜0.01，P＜0.01)，且高劑量作用更強(qiáng)。高低劑量PIO可提高PD98059干預(yù)后正常培養(yǎng)(P＜0.01，P＜0.01)和模擬IR培養(yǎng)(P＜0.01，P＜0.01)細(xì)胞GLUT1mRNA表達(dá)；正常培養(yǎng)時(shí)，高劑量PIO可提高PD98059干預(yù)后(P＜0.01)細(xì)胞G

15、LUT4mRNA表達(dá)量；模擬IR培養(yǎng)時(shí)高低劑量PIO均可提高PD98059干預(yù)后細(xì)胞GLUT4mRNA表達(dá)量(P＜0.01，P＜0.05)；而PIO對PD98059干預(yù)后細(xì)胞mTORmRNA的表達(dá)無影響。培養(yǎng)液中同時(shí)加入PD98059和LY294002可明顯減少正常培養(yǎng)及模擬IR培養(yǎng)VSMCs增殖；再加入PA，可刺激細(xì)胞增殖，而RAP和高低劑量PIO均能阻斷PA的作用。兩種劑量PIO均對PA誘導(dǎo)的正常培養(yǎng)和模擬IR培養(yǎng)細(xì)胞mTORmRN

16、A的表達(dá)增加無明顯影響。PA增加GLUT1mRNA的表達(dá)，RAP可抑制此作用，兩種劑量PIO可上調(diào)PA誘導(dǎo)的GLUT1mRNA表達(dá)(P＜0.01)，而PA和RAP對GLUT4mRNA的表達(dá)均未見明顯影響。 結(jié)論： PIO上調(diào)正常培養(yǎng)和模擬IR培養(yǎng)細(xì)胞的NOS活性，尤其是iNOS活性，增加NO含量，抑制VSMCs增殖。PIO能明顯抑制PI3K-PKB-mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制VSMCs增殖，但不直接影響mTORmRNA表