FIZZ1-RELM-α誘導(dǎo)α-平滑肌動(dòng)蛋白和Ⅰ型膠原在大鼠哮喘模型中高表達(dá)試驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是由多種細(xì)胞(如嗜酸性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等)和細(xì)胞組份參與的氣道炎癥性疾患。其主要病理特征是急慢性氣道炎癥，平滑肌功能紊亂和氣道重塑，是危害人類健康的常見病和多發(fā)病。早期研究認(rèn)為哮喘是完全可逆性疾病，然而目前研究顯示哮喘的自然過程并非完全可逆。其根本原因可能是部分哮喘患者發(fā)生了早期的氣道重塑。氣道重塑的定義主要是以組織學(xué)描述為主，其中轉(zhuǎn)變表型的肌成纖維細(xì)胞和膠原沉積是早期氣道重塑的重要

2、特點(diǎn)。此類轉(zhuǎn)變表型的肌成纖維細(xì)胞能夠表達(dá)α-平滑肌動(dòng)蛋白(α-SMA)，α-SMA是肌纖維細(xì)胞亞類之一，具有收縮潛能和較強(qiáng)的膠原合成能力，可導(dǎo)致管腔收縮。同時(shí)轉(zhuǎn)變表型的肌成纖維細(xì)胞也是肺內(nèi)膠原合成的主要細(xì)胞，它的聚集可促進(jìn)膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，尤其是Ⅰ型膠原，促使管壁增厚。所以a-SMA和Ⅰ型膠原被認(rèn)為是判斷氣道重塑的重要指標(biāo)?，F(xiàn)已知哮喘早期氣道重塑是多基因參與的結(jié)果，大量細(xì)胞因子活化，促進(jìn)炎癥基因表達(dá)，引起氣道高反應(yīng)性和氣道結(jié)構(gòu)

3、改變，致使哮喘早期氣道重塑形成。此過程中炎癥基因“發(fā)現(xiàn)于炎癥區(qū)分子1”(FIZZ1)的作用和功能備受關(guān)注。FIZZl或RELM-α是2000年首次發(fā)現(xiàn)的獨(dú)立新基因，命名為“發(fā)現(xiàn)于感染區(qū)”或者“類抵抗素分子”。其在肺和心臟等器官中特異性表達(dá)，并且在過敏性疾病中顯著高表達(dá)。同時(shí)FIZZ1也在小鼠慢性低氧肺模型中顯著高表達(dá)，因此FIZZ1也被稱為低氧誘導(dǎo)的有絲分裂因子(HlMF)。研究顯示FIZZ1在肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型的氣道上皮細(xì)胞和肺泡Ⅱ

4、型上皮細(xì)胞(AECⅡ)中特異性高表達(dá)，并且誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積?，F(xiàn)已知哮喘患者早期氣道重塑也就是氣道纖維化的過程，因此，上述研究為哮喘氣道重塑過程提供了重要的線索。因此我們提出如下假說：FIZZ1可能是早期氣道重塑中重要的炎癥基因，誘導(dǎo)α-SMA和Ⅰ型膠原等氣道重塑的重要指標(biāo)高表達(dá)。本研究擬通過探討支氣管哮喘大鼠肺組織Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞FIZZ1的表達(dá)水平，并觀察肺支氣管內(nèi)早期氣道重塑的表現(xiàn)。同時(shí)運(yùn)用體外轉(zhuǎn)染FIZZ1基

5、因的方法，進(jìn)一步證實(shí)FIZZ1對(duì)α-SMA和Ⅰ型膠原等早期氣道重塑主要指標(biāo)的直接調(diào)節(jié)作用，描述炎癥基因FIZZ1與早期氣道重塑的關(guān)系。本研究通過揭示炎癥基因FIZZ1在哮喘發(fā)病過程中的作用，進(jìn)一步闡述哮喘的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)，也為尋求阻斷早期氣道重塑和不可逆氣流受限的方法，提供了理論依據(jù)。因此研究并應(yīng)甩FIZZ1阻斷劑，將是一種很有前景的針對(duì)性治療策略。 方法： 健康WT大鼠70只，將大鼠隨機(jī)分為生理鹽水組(saline g

6、roup)，OVA哮喘組(OVA group)等各35只。復(fù)制大鼠哮喘模型；檢測(cè)大鼠的肺功能指標(biāo)：氣道阻力(Re)和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Cldyn)；分離兩組肺組織中Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞(AECⅡ)；采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)FIZZ1mRNA的表達(dá)強(qiáng)度；免疫組化法測(cè)定肺支氣管中α-SMA表達(dá)水平；對(duì)肺成纖維細(xì)胞體外轉(zhuǎn)染pEGFP-FIZZ1融合質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒，并且加入TGF-β1抗體，排除其對(duì)肌成纖維細(xì)胞的誘導(dǎo)作用；

7、采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定成纖維細(xì)胞提取物中的Ⅰ型膠原表達(dá)水平，同時(shí)采用免疫印跡法(western blotting)測(cè)定成纖維細(xì)胞提取物中α-SMA表達(dá)強(qiáng)度。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用SPSS10.0軟件處理。樣本間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01表示有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。x線片和電泳圖采用Alphalmager 2200圖象分析軟件，免疫組化圖片采用Image-

8、prol-plus(美國馬里蘭公司生產(chǎn))軟件分析。 結(jié)果： 1．大鼠造模成功的臨床表現(xiàn)以大鼠出現(xiàn)煩躁不安、活動(dòng)頻繁、呼吸急促、縮胸收腹，上肢抬起，點(diǎn)頭呼吸，以及大小便失禁等為誘喘成功的標(biāo)志。 2．大鼠肺氣道阻力(Re)和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性(Cldyn)的測(cè)定吸入濃度為0.025mg/Kg的ACH后，兩組大鼠的氣道阻力和肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性的實(shí)測(cè)值/基礎(chǔ)值基本無差別(P=0.379，P=0.843)：ACH濃度的提高到(0.05

9、-0.2mg/kg)，oVA哮喘組氣道阻力的實(shí)測(cè)值／基礎(chǔ)值增高比例明顯高于生理鹽水組(P<0.05)，同時(shí)OVA哮喘組肺動(dòng)態(tài)順應(yīng)性的實(shí)測(cè)值/基礎(chǔ)值顯著低于生理鹽水組(P<0.05)。 3．HE染色觀察肺部炎癥表現(xiàn)病理證實(shí)造模成功：大鼠OVA哮喘組中可見肺支氣管上皮細(xì)胞脫落壞死，氣管腔內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，包括嗜酸性粒細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞等，以及管壁增厚，管腔狹窄等炎癥表現(xiàn)。 4．免疫組化檢測(cè)肺組織內(nèi)支氣管α-SMA的表達(dá)水平大

10、鼠OVA哮喘組中可見肺支氣管壁上存在大量被染成褐色α-SMA陽性免疫反應(yīng)，OVA哮喘組發(fā)生了氣道重塑：生理鹽水組中可見α-SMA免疫反應(yīng)信號(hào)呈陰性反應(yīng)，僅可見到少數(shù)肺內(nèi)血管壁平滑肌呈弱陽性，未發(fā)生明顯的氣道重塑(P=1.49x10-5)。 5．FIZZ1 mRNA在Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的表達(dá)水平肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞呈立方形，相互連接鑲嵌成片，呈島形分布。OVA哮喘組肺組織中FIZZ1 mRNA在AECⅡ中的表達(dá)強(qiáng)度較生理鹽水組顯著增強(qiáng)，

11、具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=2.71×10-8)。 6．FIZZ1 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度與α-SMA的相關(guān)性肺泡Ⅱ型上皮內(nèi)FIZZ1 mRNA的表達(dá)強(qiáng)度與肺組織中α-SMA呈線性正相關(guān)(r=0.95，P=3.24×10-6)。 7．肺內(nèi)成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原的表達(dá)水平轉(zhuǎn)染pEGFP-FIZZ1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染組中纖維細(xì)胞提取物中的Ⅰ型膠原含量顯著高于轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的對(duì)照組，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=3.64×10-4)。 8．肺

12、內(nèi)成纖維細(xì)胞中α-SMA的蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)染組成纖維細(xì)胞提取物中α-SMA的蛋白表達(dá)水平顯著增強(qiáng)，而對(duì)照組無明顯表達(dá)。兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0065)。 結(jié)論： 1．FIZZ1在哮喘動(dòng)物模型Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)特異性高表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)哮喘模型支氣管壁α-SMA蛋白的高表達(dá)。 2．FIZZ1可誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化，促使哮喘早期氣道重塑特異性指標(biāo)α-SMA和Ⅰ型膠原表達(dá)增強(qiáng)。證實(shí)FIZZ1是能夠獨(dú)立引起哮喘早期氣