β3腎上腺素受體激動(dòng)劑對(duì)C57BL-6J小鼠脂肪組織棕色化相關(guān)基因和microRNAs的影響.pdf

1、背景：
　　 隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和生活方式的改變，肥胖的患病率迅速升高，已經(jīng)成為威脅人類健康的最重要的世界性公共衛(wèi)生問題之一。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，1980年以來(lái)，全球肥胖癥人數(shù)已增長(zhǎng)了1倍。2008年全球20歲及以上的成年人中超重的人數(shù)達(dá)14億，而這些超重的人當(dāng)中又有2億的男性和3億的女性為肥胖。據(jù)估計(jì)，到2030年，全球超重人口將突破21.6億，肥胖人口將達(dá)到11.2億。
　　 肥胖是高血壓、冠心病、糖尿病等疾病的危險(xiǎn)因

2、素，WHO的相關(guān)資料表明，肥胖已經(jīng)成為當(dāng)今世界第5大死亡原因。在全球范圍內(nèi)，肥胖在成人的患病率已經(jīng)超過了10％，此外，44％的糖尿病、23％的缺血性心臟病、7％-41％不同腫瘤可歸因于超重和肥胖。由此可見，肥胖已經(jīng)成為當(dāng)今最迫切需要解決的健康問題之一。
　　 肥胖是在長(zhǎng)期能量攝取超過能量消耗的情況下導(dǎo)致白色脂肪在機(jī)體內(nèi)沉積所致。與限制飲食相比，人們更傾向于提高能量代謝率來(lái)消耗過剩的脂肪。運(yùn)動(dòng)減肥是一種很好的方式，但是由于現(xiàn)代人生

3、活節(jié)奏快工作壓力大，許多人難以保證有足夠的運(yùn)動(dòng)量來(lái)達(dá)到減肥的目的。在治療肥胖方面，絕大多數(shù)減肥藥由于各種各樣的副作用而離開臨床應(yīng)用。因此我們迫切需要找到治療肥胖的新的途徑。棕色脂肪由于其獨(dú)特的生理功能，近年來(lái)成為研究肥胖治療重要靶點(diǎn)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的脂肪組織可以分為白色脂肪和棕色脂肪。白色脂肪是通過甘油三酯的形式儲(chǔ)存機(jī)體過剩的能量，并可分泌多種脂肪因子調(diào)節(jié)能量代謝。而棕色脂肪可以通過氧化游離脂肪酸產(chǎn)熱，從而維持人體在寒冷刺激時(shí)的體溫平衡，

4、或消耗機(jī)體過剩的能量達(dá)到機(jī)體的能量平衡。棕色脂肪細(xì)胞里含有很多線粒體，這些線粒體內(nèi)膜表面含有大量組織特異性非常高的解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)，UCP1能夠通過運(yùn)送質(zhì)子消除線粒體跨膜電位，從而使線粒體氧化磷酸化的過程解偶聯(lián)，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)脂肪消耗并以熱能的形式得到釋放。這對(duì)于機(jī)體在寒冷刺激等情況下的適應(yīng)性產(chǎn)熱來(lái)說是非常重要的。不僅如此，棕色脂肪周圍還布有豐富的毛細(xì)血管，交感神經(jīng)纖維也能夠直接到達(dá)棕色脂肪組織的細(xì)胞膜上。據(jù)估計(jì)，在完全激活的情況下，

5、50g的BAT就可以消耗機(jī)體20％的基礎(chǔ)代謝能量。
　　 過去認(rèn)為成人體內(nèi)不存在有功能的BAT，但是在2009年，5個(gè)獨(dú)立的研究組使用利用了正電子發(fā)射斷層掃描(Positron Emission Tomography，PET)和計(jì)算機(jī)斷層掃描(Computed Tomography，CT)技術(shù)證實(shí)在成人頸部和鎖骨上區(qū)域有代謝活躍區(qū)域，并取組織標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢查和分子標(biāo)志物分析，證明這些區(qū)域里有代謝活躍的棕色脂肪組織。Cypess

6、等分析了1972位成年患者PET-CT掃描結(jié)果，發(fā)現(xiàn)5.4％的患者確實(shí)擁有棕色脂肪組織;他們還發(fā)現(xiàn)棕色脂肪組織的活性與年齡、體重指數(shù)、空腹血糖水平呈負(fù)相關(guān)，這也就是說，棕色脂肪組織與這些衡量身體健康良好與否的指標(biāo)有關(guān)。成人體內(nèi)豐富的具有活性的棕色脂肪的發(fā)現(xiàn)顛覆了對(duì)棕色脂肪的認(rèn)識(shí)，也開辟了從臨床醫(yī)學(xué)角度利用棕色脂肪來(lái)治療肥胖等代謝相關(guān)疾病的嶄新領(lǐng)域。
　　 近年來(lái)，研究人員致力于將白色脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為棕色脂肪的研究。轉(zhuǎn)錄

7、因子的誘導(dǎo)是實(shí)現(xiàn)棕色脂肪轉(zhuǎn)分化的重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，C/EBPβ能夠體外誘導(dǎo)3T3L1前白色脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成為具有棕色脂肪細(xì)胞特征的細(xì)胞群。而成肌細(xì)胞則能夠在PRDM16-C/EBPβ轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的作用下轉(zhuǎn)分化成為具有生理功能的棕色脂肪。此外PRDM16-C/EBPβ轉(zhuǎn)錄復(fù)合體還能夠?qū)崿F(xiàn)由成纖維細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。脂肪特異性過表達(dá)PRDM16的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)皮下白色脂肪棕色化現(xiàn)象，而內(nèi)臟白色脂肪沒有出現(xiàn)這種現(xiàn)象。
　　 m

8、icroRNA是非編碼RNA(ncRNAs)中的一種，可以在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)性調(diào)控蛋白表達(dá)。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的microRNAs調(diào)節(jié)超過60％的編碼蛋白的基因，而一種microRNA可以調(diào)控?cái)?shù)百種不同基因的mRNA。microRNA在脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過程中也能起到非常重要的作用。脂肪特異性過表達(dá)miR-196a的轉(zhuǎn)基因小鼠中，皮下白色脂肪和內(nèi)臟白色脂肪都出現(xiàn)明顯的棕色化。Sun等發(fā)現(xiàn)在C2C12肌原細(xì)胞系中過表達(dá)miR-193b/365，可以誘

9、導(dǎo)分化棕色脂肪細(xì)胞;而在棕色脂肪前體細(xì)胞中敲除miR-193b/365，可以誘導(dǎo)分化為肌細(xì)胞。而2013年最新的研究結(jié)果表明，miR-133能夠通過調(diào)控PRDM16實(shí)現(xiàn)由肌細(xì)胞向棕色脂肪細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。最近的研究也揭示了miR-155是棕色脂肪重要的“microRNA開關(guān)”。miR-155轉(zhuǎn)基因小鼠中UCP1表達(dá)受到抑制，miR-155敲除小鼠中UCP1表達(dá)則被激活。
　　 從能量平衡的角度看，通過增加產(chǎn)熱從而提高能量的消耗來(lái)減輕

10、體重，可以作為為一種抵抗肥胖的重要手段。在成年人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)具有活性的棕色脂肪后，研究人員就希望能夠通過調(diào)節(jié)棕色脂肪的產(chǎn)熱功能來(lái)治療及預(yù)防肥胖和其相關(guān)的疾病。展望未來(lái)，有兩種途徑來(lái)增加棕色脂肪的總量和活性:一是通過小分子藥物或者生長(zhǎng)因子來(lái)刺激體內(nèi)棕色脂肪的生長(zhǎng)分化和激活;二是通過體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成棕色脂肪細(xì)胞，然后植入肥胖患者體內(nèi)，從某種意義上說就是脂肪組織移植。
　　 由于肥胖已經(jīng)成為現(xiàn)代社會(huì)中嚴(yán)重危害健康的公共衛(wèi)生問題。如前所

11、述，肥胖與棕色脂肪有著相當(dāng)緊密的聯(lián)系。MicroRNA可以通過抑制翻譯的過程或者使mRNA降解而廣泛地參與到機(jī)體發(fā)育、細(xì)胞增殖和凋亡等過程中。近來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)microRNA在白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)分化過程中也起著重要的作用。然而是否存在更多的microRNA能夠促進(jìn)白色脂肪棕色化仍需要進(jìn)一步探討。UCP1是棕色脂肪適應(yīng)性產(chǎn)熱的關(guān)鍵基因，但關(guān)于調(diào)控UCP1的microRNA的相關(guān)研究較少。因此，研究以UCP1為靶基因的相關(guān)microRN

12、A可以更為深入地研究白色脂肪棕色化過程，從而為開發(fā)預(yù)防和治療肥胖的藥物打下良好的基礎(chǔ)。
　　 研究分為以下2部分進(jìn)行:
　　 第一章、β3腎上腺素受體激動(dòng)劑(CL316243)對(duì)C57BL/6J小鼠脂肪組織棕色化相關(guān)基因的影響
　　 目的：研究β3腎上腺素受體激動(dòng)劑(CL316243)處理的小鼠附睪脂肪、腹股溝脂肪、肩胛區(qū)棕色脂肪中的棕色化相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量。
　　 方法：
　　 1.14只

13、6周齡C57BL/6 J雄性小鼠隨機(jī)分成2組，每組7只。實(shí)驗(yàn)組小鼠每天腹腔注射β3腎上腺素受體激動(dòng)劑CL316，243(劑量為1mg/Kg)，對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水。每天注射1次，連續(xù)注射10天，取小鼠肩胛間區(qū)的棕色脂肪組織、腹股溝區(qū)的皮下脂肪組織和內(nèi)臟的附睪脂肪，收集標(biāo)本后立即放入-80℃保存。
　　 2.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)附睪脂肪內(nèi)UCP1、CIDEA、DIO2、CPT1B、PGC-1α、C/EBPβ、PRDM

14、16、PPARγ2基因mRNA的表達(dá)量。
　　 3.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腹股溝脂肪內(nèi)UCP1、CIDEA、PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16、PPARγ2基因mRNA的表達(dá)量。
　　 4.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)肩胛區(qū)棕色脂肪內(nèi)UCP1、CIDEA、PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16、PPARγ2基因mRNA的表達(dá)量。
　　 5.HE染色法觀察小鼠附睪脂肪細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 6

15、.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，各指標(biāo)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示，兩組間進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.與對(duì)照組相比，CL316243組小鼠附睪脂肪和腹股溝脂肪中，脂肪合成相關(guān)基因PPARγ2mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)，而在棕色脂肪中PPARγ2 mRNA表達(dá)也下調(diào)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2.與對(duì)照組相

16、比，CL316243組小鼠附睪脂肪中，棕色脂肪特異基因UCP1、CIDEA、DIO2和脂肪酸氧化相關(guān)基因CPT1BmRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05);其他棕色脂肪分化相關(guān)PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16基因的mRNA表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 3.與對(duì)照組相比，CL316243組小鼠腹股溝脂肪中棕色脂肪特異基因UCP1、CIDEA和棕色脂肪分化相關(guān)基因PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16的mRNA表達(dá)

17、均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 4.與對(duì)照組相比，CL316243組小鼠肩胛區(qū)棕色脂肪中棕色脂肪特異基因UCP1、CIDEA和棕色脂肪分化相關(guān)基因PGC-1α、C/EBPβ、PRDM16的mRNA的表達(dá)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 5.HE染色法觀察兩組小鼠附睪脂肪的形態(tài)學(xué)變化，對(duì)照組附睪脂肪呈現(xiàn)出大空泡的脂肪球，細(xì)胞核、細(xì)胞器及胞漿被擠到一側(cè)呈薄環(huán);在CL316243組附睪脂肪中，脂肪細(xì)胞較小，部分細(xì)

18、胞核位于細(xì)胞中間，脂滴分散在多房室內(nèi)。
　　 結(jié)論：
　　 1.β3腎上腺素受體激動(dòng)劑CL316243可以下調(diào)腹股溝和附睪脂肪脂肪合成能力;
　　 2.β3腎上腺素受體激動(dòng)劑CL316243可以使附睪脂肪棕色化、脂肪酸氧化水平提高，從而提高小鼠的能量代謝水平。
　　 第二章、β3腎上腺素受體激動(dòng)劑(CL316243)對(duì)C57BL/6J小鼠脂肪組織棕色化相關(guān)microRNAs的影響
　　 目的：初步

19、探討β3腎上腺素受體激動(dòng)劑(CL316243)對(duì)以UCP1為靶基因的microRNA的影響。
　　 方法：
　　 1.以UCP1為檢索詞，在miranda數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶向microRNA的預(yù)測(cè)，并篩選出最有可能以UCP1為靶基因的microRNA。
　　 2.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)腹股溝脂肪內(nèi)以UCP1為靶基因的miR-9、miR-338-3p及非相關(guān)的miR-let7g的mRNA表達(dá)量。
　　 結(jié)果