C57BL-6J小鼠白色脂肪與棕色脂肪組織蛋白質組學研究.pdf

1、目的:
　　建立正常C57BL/6J小鼠白色脂肪和棕色脂肪組織蛋白質表達譜;利用高脂飲食誘導肥胖C57BL/6J小鼠模型，探討肥胖小鼠白色脂肪和棕色脂肪組織蛋白質表達變化;通過對肥胖小鼠分別給予二甲雙胍和利拉魯肽干預，探索兩種藥物干預對白色脂肪和棕色脂肪蛋白表達譜的影響及其機制。
　　方法:
　　6周齡雌性C57BL/6J小鼠高脂喂養(yǎng)22周，建立肥胖小鼠模型。將肥胖小鼠隨機分為三組，分別為二甲雙胍干預組(MET，n=1

2、2)、利拉魯肽干預組(GLP-1，n=12)，肥胖對照組(HFD，n=12)，此外設立正常飲食對照組(NOR，n=10)。藥物干預8周，監(jiān)測各組小鼠的攝食量、體重;行胰島素耐量試驗、糖耐量試驗、高胰島素正常葡萄糖鉗夾試驗;檢測血脂、血清瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素水平;測量性腺周圍白色脂肪組織與肩胛區(qū)棕色脂肪重量;提取脂肪組織蛋白質并進行酶切，應用基于液相色譜串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)的非標記定量蛋白組學技術，鑒定正常C57BL/6J小鼠白色

3、脂肪和棕色脂肪組織蛋白質表達譜，并對所鑒定蛋白進行定性及定量分析。分別對白色脂肪表達蛋白、棕色脂肪表達蛋白以及二者的差異表達蛋白進行生物信息學分析。應用同位素標記相對或絕對定量(iTRAQ)聯(lián)合LC-MS/MS的方法，研究高脂飲食小鼠和正常飲食小鼠白色脂肪組織和棕色脂肪組織差異蛋白的表達情況，同時觀察二甲雙胍和利拉魯肽干預對肥胖小鼠白色脂肪和棕色脂肪蛋白表達的影響。
　　結果:
　　(1)建立正常小鼠白色脂肪和棕色脂肪蛋白質

4、組表達譜。
　　A.應用基于液相色譜串聯(lián)質譜的非標記定量蛋白組學技術，鑒定正常C57BL/6J小鼠白色脂肪的蛋白數為5847種，最終定量蛋白數為5408種;棕色脂肪鑒定的蛋白數為4706種，最終定量蛋白數為4260種;其中白色脂肪和棕色脂肪共同表達蛋白3857種，兩種組織蛋白相對表達量作比，比值大于4倍的蛋白為1440種，界定為白色脂肪和棕色脂肪相對表達量差異蛋白。
　　B.白色脂肪和棕色脂肪上述定量蛋白通過IPA軟件分析，

5、其中最主要的相關疾病為腫瘤，最重要的相關信號通路為EIF2（真核生物啟動因子2）信號通路。
　　C.白色脂肪和棕色脂肪相對表達量差異蛋白最主要的相關生物功能為炎癥反應，且在白色脂肪中蛋白表達量相對高;重要的相關信號通路為線粒體功能，在棕色脂肪中蛋白表達量相對高;此外，二者差異蛋白相對集中的生物過程為能量產生和脂質代謝過程。
　　(2)建立肥胖小鼠模型，二甲雙胍和利拉魯肽干預對肥胖小鼠體重、脂肪含量、胰島素敏感性、血糖、血脂及

6、脂肪因子具有不同程度的改善。
　　A.高脂飲食喂養(yǎng)22周后，小鼠體重顯著增加，與正常飲食組相比，是其體重的1.6倍(p=0.000)。MET組給藥第8周平均體重較HFD組顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(p=0.033); GLP-1組小鼠在給予利拉魯肽干預第8周，與HFD組相比，體重下降(p=0.000)。與NOR組相比，HFD組小鼠白色脂肪組織含量（脂肪組織重量/體重*100％）增加(p=0.004)，而利拉魯肽干預可以減少腹腔白色

7、脂肪組織的含量(p=0.045)，MET組與HFD組腹腔白色脂肪組織含量沒有顯著性差異。與NOR組相比，HFD組棕色脂肪減少具有統(tǒng)計學意義(p=0.024)，而利拉魯肽和二甲雙胍干預對棕色脂肪組織的含量沒有顯著性影響。
　　B.高胰島素正常葡萄糖鉗夾試驗，利用葡萄糖輸注率(Glucose infusion rate，GIR)評價胰島素敏感性。HFD組GIR低于NOR組，且具有統(tǒng)計學差異(p=0.001)，與HFD組相比，二甲雙胍和

8、利拉魯肽干預后，GIR增加均具有統(tǒng)計學顯著性(p＜0.05)，而二甲雙胍與利拉魯肽之間無顯著性差異(p=0.22)。
　　C.高脂飲食顯著升高小鼠甘油三酯和總膽固醇水平，HFD組小鼠TC較NOR組小鼠升高(p=0.000)，HFD組小鼠TG升高(p=0.004)。利拉魯肽干預后，TC水平下降具有統(tǒng)計學顯著性(p=0.02)，而二甲雙胍對TC的影響沒有顯著性差異(p=0.90)。二甲雙胍與利拉魯肽干預均可以降低TG水平，且具有統(tǒng)計學

9、意義(p＜0.05)。
　　D.高脂飲食可以顯著性上調小鼠血清瘦素的水平(p=0.000)，二甲雙胍和利拉魯肽干預可以下調血清瘦素的水平(p＜0.05)。與NOR組相比，HFD組脂聯(lián)素水平降低具有統(tǒng)計學顯著性(p=0.000)，二甲雙胍干預與利拉魯肽干預可以使脂聯(lián)素水平上調，且差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。四組血清抵抗素水平變化無顯著性差異(p=0.349)。
　　(3)應用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS，研究HFD組

10、、MET組、GLP-1組小鼠白色脂肪和棕色脂肪蛋白表達變化。
　　A.白色脂肪組織中共鑒定總蛋白數4388種，其中可定量蛋白數為4061種，棕色脂肪組織共鑒定總蛋白數3486種，其中可定量的蛋白數為3212種。以NOR組為參照，HFD組、MET組和GLP-1組鑒定出1.5倍以上差異蛋白在白色脂肪中分別為529種、363種和240種，棕色脂肪中鑒定出1.5倍以上差異蛋白分別為727種、240種和217種。
　　B.通過對差異蛋

11、白的生物功能進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)白色脂肪和棕色脂肪差異蛋白主要集中在脂質代謝、分子轉運、小分子生物化學、心血管疾病、糖代謝等生物功能。二甲雙胍和利拉魯肽干預后對糖代謝、脂代謝等機體代謝狀態(tài)有一定的改善作用。
　　C.通過對差異蛋白的信號通路進行綜合分析，發(fā)現(xiàn)白色脂肪組織差異蛋白主要集中在EIF2（真核生物啟動因子2）信號通路、LXR/RXR（肝臟X受體/類維生素AX受體）活化通路和急性時相反應等信號通路。棕色脂肪差異蛋白主要集中在線

12、粒體功能障礙通路、氧化磷酸化通路和EIF2等信號通路。
　　結論:
　　1.白色脂肪和棕色脂肪鑒定蛋白最主要的相關疾病為腫瘤，由此提示，脂肪組織的生物活動可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在內在聯(lián)系。最重要的相關信號通路為EIF2（真核生物啟動因子2）信號通路，該通路在細胞外生長因子、激素、促細胞分裂劑或細胞因子的刺激下，參與細胞生長和增殖、蛋白合成等生物活動。
　　2.白色脂肪和棕色脂肪相對表達量差異蛋白相關生物功能分析提示白色

13、脂肪組織中存在更多與炎癥反應相關的蛋白;差異蛋白相關信號通路分析提示棕色脂肪功能蛋白主要為線粒體蛋白;此外，二者差異蛋白相互作用網絡分析提示白色和棕色脂肪主要在炎癥反應、能量產生和脂質代謝過程中發(fā)揮作用。
　　3.高脂飲食可能通過EIF2信號通路促進小鼠白色脂肪蛋白合成與細胞增殖，但對棕色脂肪沒有顯著作用;它還可以抑制白色脂肪和棕色脂肪的糖代謝和脂肪合成，使脂肪分解代償性增加;同時，可能通過降低棕色脂肪細胞自由基清除劑的活性，引起

14、細胞氧化應激，促發(fā)棕色脂肪細胞凋亡增加，而白色脂肪中未見此反應;此外，高脂飲食可能通過一定機制促進白色脂肪的“棕色化”。在高脂飲食過程中，小鼠白色脂肪可以出現(xiàn)代償性保護作用，而棕色脂肪可能較白色脂肪細胞更易受到氧化應激損傷而出現(xiàn)凋亡，從而促進肥胖的發(fā)生。
　　4.二甲雙胍和利拉魯肽干預在對肥胖小鼠體重及胰島素敏感性改善的同時，對小鼠白色脂肪和棕色脂肪中EIF2信號通路、線粒體功能障礙及脂質代謝均有一定的改善作用。二甲雙胍對白色脂肪