慢性炎癥致C57BL-6J小鼠糖代謝紊亂及其相關(guān)分子機(jī)制的研究.pdf

1、第一部分小鼠慢性系統(tǒng)性炎癥模型的建立
　　目的:慢性低豐度炎癥與氧化應(yīng)激在炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。促炎癥因子（CRP、IL-6、TNF-α）與糖耐量減低、肥胖及動(dòng)脈粥樣硬化等密切相關(guān)。本研究通過對(duì)C57BL/6J野生型小鼠連續(xù)皮下注射10％酪蛋白14周建立慢性炎癥模型，以模擬人體內(nèi)慢性炎癥狀態(tài)，并檢測小鼠血清炎癥因子水平及肝臟組織中炎癥相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)水平。
　　方法:將8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為

2、四組:普通飲食組(NCD，n=12)，普通飲食+炎癥組(NCD+Casein，n=12)，高脂飲食組（HFD，n=12），高脂飲食+炎癥組(HFD+Casein，n=12)。其中高脂飲食84％的能量來自脂肪。NCD+Casein組及HFD+Casein組隔日皮下注射0.5ml10％酪蛋白，NCD組及HFD組隔日皮下注射0.5ml生理鹽水作為對(duì)照。飼養(yǎng)14周后處死，收集小鼠血漿及肝臟組織。ELISA法檢測血清及肝臟組織TNF-α、SAA水

3、平。實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot方法分別檢測肝臟組織中TNF-α、MCP-1基因及蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果:(1)分別給予普通飲食及高脂飲食飼養(yǎng)14周后，皮下注射酪蛋白組小鼠血清中SAA、TNF-α含量均明顯高于各自對(duì)照組(P＜0.05)。(2)實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:NCD+Casein組及HFD組小鼠肝臟組織TNF-α、MCP-1基因表達(dá)與NCD組明顯增加(P＜0.05);與HFD組相比，HFD+Casein組肝臟

4、組織MCP-1基因表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。(3) Western blot結(jié)果顯示:與各自對(duì)照組相比，NCD+Casein及HFD+Casein組小鼠肝臟組織TNF-α、MCP-1蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.05)。
　　結(jié)論:通過連續(xù)皮下注射10％酪蛋白14周后，小鼠血清及肝臟組織中炎癥因子水平均明顯增加，說明成功建立了小鼠慢性炎癥模型，能夠更好的模擬人體內(nèi)慢性低豐度炎癥狀態(tài)。
　　第二部分慢性炎癥對(duì)C57BL/6J小

5、鼠糖代謝的影響
　　目的:慢性炎癥與代謝性疾病密切相關(guān)，能夠增加患代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)。代謝性疾病是指包括糖尿病、肥胖、脂代謝異常及動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病等在內(nèi)的一系列代謝紊亂癥侯群。本實(shí)驗(yàn)旨在通過建立C57BL/6J小鼠慢性炎癥模型，觀察慢性炎癥對(duì)小鼠糖代謝的影響。
　　方法:全自動(dòng)生化分析方法檢測血糖水平;ELISA方法檢測血清胰島素含量;葡萄糖耐量試驗(yàn)和胰島素耐量試驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠胰島素抵抗程度。
　　結(jié)果:與對(duì)照組相比，炎

6、癥處理組小鼠空腹血糖明顯增加;糖負(fù)荷后，炎癥組小鼠與各自對(duì)照組相比，各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血糖水平均明顯升高，說明慢性炎癥使C57BL/6J小鼠葡萄糖耐量受損。胰島素耐量試驗(yàn)結(jié)果顯示，注射胰島素后，對(duì)照組小鼠血糖急劇下降，30min時(shí)下降至基礎(chǔ)血糖水平（0h血糖水平）的40％。NCD+Casein組及HFD組血糖下降緩慢，并很快升高。聯(lián)合處理組（HFD+Casein）0-30min血糖下降緩慢，至120min仍持續(xù)下降，未向基礎(chǔ)水平回復(fù)。說明慢性

7、炎癥使C57BL/6J小鼠胰島素的敏感性降低。
　　結(jié)論:慢性炎癥使C57BL/6J小鼠空腹血糖水平增加，葡萄糖耐量受損及對(duì)胰島素的敏感性降低。
　　第三部分慢性炎癥對(duì)肝臟組織糖異生及胰島素相關(guān)信號(hào)通路的影響
　　目的:肝細(xì)胞通過糖異生和糖酵解途徑調(diào)節(jié)葡萄糖生成與利用的平衡，對(duì)維持血漿葡萄糖穩(wěn)態(tài)發(fā)揮著重要作用。肝葡萄糖生成失調(diào)，特別是糖異生作用的增加所致的高血糖在一定程度上與糖尿病的發(fā)生有關(guān)。肝臟糖異生受一系列轉(zhuǎn)錄因子

8、的調(diào)控，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G-6-Pase）是肝臟糖異生信號(hào)通路中的關(guān)鍵酶。近年來發(fā)現(xiàn)慢性系統(tǒng)性炎癥是導(dǎo)致胰島素抵抗的重要因素之一。在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，胰島素失去了其抑制糖異生的作用，使肝臟葡萄糖輸出增加，產(chǎn)生高血糖和葡萄糖耐量減低。mTOR是新發(fā)現(xiàn)的機(jī)體細(xì)胞內(nèi)營養(yǎng)成分的重要感受器，與胰

9、島素抵抗(IR)的發(fā)生密切相關(guān)。慢性炎癥是否可以通過活化mTOR信號(hào)通路進(jìn)一步加重胰島素抵抗目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)旨在探討慢性炎癥對(duì)肝臟組織糖異生的影響及慢性炎癥能否通過激活mTOR/S6K信號(hào)通路而誘導(dǎo)胰島素受體底物-1（IRS-1）發(fā)生異常磷酸化(絲氨酸/蘇氨酸(ser/thr)磷酸化增加，酪氨酸(tyr)磷酸化減少），從而使胰島素受體后信號(hào)傳導(dǎo)通路受損，胰島素抑制糖異生作用減弱，誘導(dǎo)胰島素抵抗。
　　方法:實(shí)時(shí)定量PCR方法檢

10、測肝臟組織糖異生相關(guān)的PEPCK、G-6-Pase的基因表達(dá)水平;Western blot分別檢測肝臟組織PEPCK、G-6-Pase的蛋白表達(dá)水平;過碘酸-希夫(periodic acid-Schiff, PAS)染色觀察肝細(xì)胞糖原顆粒;Western blot檢測胰島素信號(hào)通路及mTOR信號(hào)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)及其磷酸化水平。
　　結(jié)果:實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:在小鼠肝臟組織中，與NCD組相比，NCD+Casein組、HFD組

11、PEPCK、G-6-Pase的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)(P＜0.05);與HFD組相比，HFD+Casein組PEPCK、G-6-Pase的mRNA表達(dá)亦明顯上調(diào)(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示肝臟組織PEPCK、G-6-Pase蛋白表達(dá)與基因表達(dá)相一致。PAS染色結(jié)果顯示:與NCD組相比，NCD+Casein組、HFD組肝臟組織糖原含量增多;與HFD組相比，HFD+Casein組肝臟糖原含量明顯增多。同時(shí)我們觀察到炎癥組

12、小鼠肝臟組織在中mTOR、S6K總蛋白及磷酸化蛋白表達(dá)增強(qiáng)，IRS1、PI3K、Akt、pAkt蛋白表達(dá)減弱，同時(shí)IRS1絲氨酸/蘇氨酸磷酸化表達(dá)增強(qiáng)而IRS1酪氨酸磷酸化減弱。
　　結(jié)論:慢性炎癥使C57BL/6J小鼠肝臟組織糖異生相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子PEPCK、G-6-Pase表達(dá)增加，糖異生作用增加。同時(shí)，慢性炎癥可激活mTOR/S6K信號(hào)通路，促使IRS1的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化從而阻礙IRS1正常的酪氨酸磷酸化，使胰島素沿正常的