香蕉枯萎病菌2小種間Mads1和Flo1的比較與致病功能研究.pdf

1、香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴?；停‵oc）引起的維管束系統(tǒng)性病害，對香蕉生產(chǎn)造成毀滅性的破壞，引起了巨大的經(jīng)濟損失。香蕉枯萎病菌1號小種（Foc1）屬于世界性分布，主要侵染粉蕉（Musa AAB），但香蕉（Cavendish AAA）較抗?。?號小種（Foc4）幾乎能感染所有的香蕉品種，為害最嚴重。由于缺乏有效的防治方法和抗病品種，通過篩選致病相關(guān)基因，完善香蕉枯萎病菌致病機理就顯得尤為重要。
　　在本研究室已獲得的三種碳源誘導(dǎo)

2、條件下香蕉枯萎病菌2小種轉(zhuǎn)錄組差異分析基礎(chǔ)上，將轉(zhuǎn)錄組結(jié)果與PHI（The Pathogen-Host Interaction Database）數(shù)據(jù)庫BLAST比對，預(yù)測致病相關(guān)基因，篩選出5個致病相關(guān)基因：轉(zhuǎn)錄因子comp11743（Mads1，PHI:1070），效應(yīng)子comp13556（Flo1，PHI：468），HC-毒素合成酶comp14892（PHI:157），G蛋白comp17731（PHI：385），幾丁質(zhì)合成酶com

3、p20887（PHI：389）。
　　實時熒光定量PCR得到了5個基因在Foc處理香蕉根后的表達量變化，comp11743（Mads1）和comp13556（Flo1）表達量上調(diào)十分明顯，comp11743（Mads1）在48 h和96 h的表達量至少較0 h上調(diào)400倍，最大可以達到900多倍；comp13556（Flo1）在48 h和96 h的表達量雖然較0 h上調(diào)的倍數(shù)不及comp11743（Mads1），但是平均都在90倍

4、以上，最大可以達到將近400倍；盡管comp14892在Foc處理香蕉根部后表達量也有上調(diào)，但是上調(diào)倍數(shù)不大，遠遠不及comp11743（Mads1）和comp13556（Flo1），而comp17731和comp20887在Foc處理香蕉根后表達量都呈下調(diào)趨勢。由于病原菌在侵染寄主時，有些基因會大量表達，因此本研究優(yōu)先選擇comp11743（Mads1）和comp13556（Flo1）這2個基因進行后續(xù)研究。
　　基因克隆測序顯

5、示：Foc1-comp11743（Mads1）和Foc4-comp11743（Mads1） DNA大小都為633 bp，DNA編碼區(qū)都為633 bp，都編碼210個氨基酸的蛋白，都無內(nèi)含子，2個小種基因編碼區(qū)域同源性為100％，編碼的氨基酸同源性為100%。Foc1-comp13556（Flo1）和Foc4-comp13556（Flo1）DNA大小都為1010 bp，DNA編碼區(qū)都為960 bp，都編碼319個氨基酸的蛋白，F(xiàn)oc1-c

6、omp13556（Flo1）和Foc4-comp13556（Flo1）都由1個內(nèi)含子和2個外顯子組成，外顯子區(qū)域同源性為99.1%，F(xiàn)oc1-comp13556和Foc4-comp3556在核苷酸水平上存在著10個位點差異，編碼的氨基酸同源性為99.4%，存在2個位點的差異。將comp11743（Mads1）、comp13556（Flo1）氨基酸序列BLASTP比對之后發(fā)現(xiàn)，comp11743（Mads1）具有一個MADS_SRF_li

7、ke功能域，屬于MADS家族中的SRF-like（I）型蛋白，因此命名為Mads1；comp13556（Flo1）具有一個PA14功能域，屬于PA14家族，與FLO（Flocculation protein）有50%同源，命名為Flo1。
　　通過TAIL-PCR獲得了Foc1-Mads1、Foc4-Mads1以及Foc1-Flo1、Foc4-Flo1目的基因的側(cè)翼序列。采用同源重組的方法，根據(jù)所測得的目的基因兩端側(cè)翼序列構(gòu)建敲除

8、載體，利用ATMT方法進行轉(zhuǎn)化，成功獲得了將Foc1和Foc4-Mads1、Flo1基因缺失的突變體 Foc1-△Mads1、Foc4-△Mads1以及 Foc1-△Flo1、Foc4-△Flo1。Foc1-△Mads1和 Foc4-△Mads1在 PDA平板上的培養(yǎng)形態(tài)基本與野生型 Foc1、Foc4一致，其菌絲生長速度也與野生型 Foc相一致，產(chǎn)孢量與野生型 Foc沒有差異。Foc1-△Flo1和Foc4-△Flo1在PDA平板上的

9、培養(yǎng)形態(tài)基本與野生型Foc1、Foc4一致，其菌絲生長速度也與野生型的Foc相一致，產(chǎn)孢量與野生型Foc沒有差異。采用浸根接種的方法，將Foc1-△Mads1、Foc4-△Mads1以及Foc1-△Flo1、Foc4-△Flo1敲除突變體和野生型Foc接種四葉期的粉蕉和巴西蕉苗，45 d后觀察結(jié)果。結(jié)果表明，F(xiàn)oc1-△Mads1、Foc4-△Mads1接種的粉蕉和巴西蕉病情指數(shù)分別是95±1.44a、92.5±1.44a與野生型 Fo

10、c相比差異不顯著，說明△Mads1基因的敲除對致病力未造成太大影響；而Foc1-△Flo1、Foc4-△Flo1接種的粉蕉和巴西蕉病情指數(shù)分別是51.66±0.83、53.33±2.2，較野生型Foc1、Foc4的病情指數(shù)低50%左右，這初步說明△Flo1基因的缺失雖然不影響Foc的正常生長，卻在一定程度上減弱了致病力。
　　綜上所述，Mads1基因和Flo1在Foc侵染時大量表達，F(xiàn)lo1初步證明可能與Foc致病力相關(guān)；Mads