香蕉枯萎病菌GFP標記和β-葡萄糖甘酶基因克隆.pdf

1、由尖孢鐮刀菌古巴專化型(Fusarium oxysporum f. sp. cubense， Foc)引起的香蕉枯萎病是香蕉的毀滅性病害，香蕉的生產帶來嚴重威脅。目前，國內香蕉生產尚無有效、穩(wěn)定的控制措施。深入研究香蕉枯萎病菌的致病特性和病菌的生理學、遺傳學特性，對進一步研究香蕉枯萎病的發(fā)生與流行規(guī)律、研究有效的控制方法均有一定的理論意義和應用價值。
　　 本研究將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein

2、, gfp)基因轉化入香蕉枯萎病菌，研究轉化后菌株的生物學特性以及在香蕉植株體內的侵染特性，為進一步研究香蕉枯萎病菌致病機理和生防提供理論基礎；同時克隆出香蕉枯萎病菌的β-葡萄糖甘酶基因，為研究此基因功能奠定基礎。主要研究結果如下：
　　 1．香蕉枯萎病株采自福建省漳州，經單孢分離、致病性測定與分子鑒定，獲得21個尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種。
　　 2．建立香蕉枯萎病菌的PEG介導原生質體法遺傳轉化系統(tǒng)，香蕉枯萎病

3、菌的原生質體的制備是整個轉化中最關鍵的一步，影響原生質體制備因素很多主要包括合適的酶液、菌絲的菌齡、制備原生質體的溶菌溫度和溶菌時間。本文轉化方法采用的是0.8mol·L-1的NaCl溶解的崩潰酶(Drislase)和溶壁酶(Lysing Enzyme)；菌齡10-14h的新鮮菌絲；28℃，70r·min-1消化酶解2-3h。
　　 3．對尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種Foc-3076菌株進行gfp標記。標記后菌株的菌絲、分生

4、孢子、厚垣孢子的形態(tài)與親本菌株形態(tài)基本相同，且在紫外光下都呈現綠色熒光。PCR驗證表明，目的基因已轉入到Foc-3076菌株。且標記后菌株較之原始菌株的抗潮霉素能力大大增加。在無選擇壓力條件下繼代培養(yǎng)6代，轉化子仍然保持強烈的綠色熒光。gfp基因標記前后的菌株在菌落形態(tài)、最佳pH值和菌絲生長速度基本一致，菌株致病力未有明顯改變，發(fā)病率均達到90％以上。
　　 4．利用激光共聚焦顯微鏡掃描觀察結果表明，標記病原菌侵染香蕉是以孢子萌