香蕉枯萎病菌進(jìn)化研究和FocTR4致病相關(guān)效應(yīng)蛋白的鑒定及功能分析.pdf

1、香蕉是世界上最重要的水果之一，也是僅次于水稻、小麥和玉米的第四大糧食作物，因此香蕉生產(chǎn)攸關(guān)世界糧食安全、地區(qū)發(fā)展和人類(lèi)健康（Ploetz R C,2006）。但是，香蕉枯萎病菌熱帶4號(hào)生理小種（Fusarium oxysporum f.sp.cubense Tropical race4）的大規(guī)模爆發(fā)和流行，已嚴(yán)重危及到該產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為了防控該病害，本課題對(duì)來(lái)自不同香蕉生產(chǎn)國(guó)的56個(gè)Foc菌株（涵蓋4個(gè)生理小種、24個(gè)營(yíng)養(yǎng)體親合群（

2、Vegetative Compatibility Groups,VCGs））進(jìn)行了基因組重測(cè)序，利用比較基因組學(xué)研究了全球范圍內(nèi)病原菌的進(jìn)化規(guī)律、鑒定了Foc TR4效應(yīng)蛋白，并對(duì)重要的蛋白開(kāi)展功能分析，具體結(jié)果如下：
　　1.香蕉枯萎病菌基因組重測(cè)序及生物信息學(xué)分析（1）基因組重測(cè)序及組裝：
　　對(duì)來(lái)自不同香蕉生產(chǎn)國(guó)的55個(gè)Foc菌株（涵蓋4個(gè)生理小種、24個(gè)VCGs），包括6株Foc TR4，8株Foc STR4(亞熱帶

3、4號(hào)小種)，35株Foc race1，2株Foc race2，2株大蕉Foc，2株非致病性尖孢鐮刀菌，進(jìn)行了基因組重測(cè)序，測(cè)序覆蓋度均在50倍以上。測(cè)序的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)濾后組裝成Contigs和Supercontigs。
　?。?）基因組Core和LS-Region的區(qū)分
　　結(jié)合公布在Broad Institute網(wǎng)站上的14種鐮刀菌基因組序列，預(yù)測(cè)了Foc TR4菌株II5的核心基因組（Core genome或者 regi

4、ons）和Lineage-specific regions（LS-Regions），并以此為參考，采用“剔除核心基因組”（Eliminating the Core Genome）的方法鑒定各個(gè)測(cè)序菌株的Core regiongs和LS regions，結(jié)果顯示不同類(lèi)型菌株間的Core和LS-Region的大小存在顯著差異。
　?。?）全球范圍內(nèi)的香蕉枯萎病菌的進(jìn)化規(guī)律
　　利用3種方法研究了全球范圍內(nèi)的Foc的進(jìn)化規(guī)律：

5、r>　?、俑鶕?jù)10個(gè)看家基因繪制的進(jìn)化樹(shù)；
　　②全基因組范圍內(nèi)的SNP繪制的進(jìn)化樹(shù)；
　?、壑鞒煞址治龇ǎ≒rincipal Component Analysis，PCA)，發(fā)現(xiàn)Foc TR4菌株進(jìn)化非常保守，是單一起源的，并且進(jìn)化速度非?？?；其它類(lèi)型菌株如Foc STR4和Race1則進(jìn)化比較復(fù)雜，有多個(gè)進(jìn)化源頭；大蕉枯萎病菌由Race1進(jìn)化而來(lái)，克服了對(duì)Race1、Foc TR4和Foc STR4有高度抗性的大蕉的免疫

6、系統(tǒng)。
　?。?）香蕉枯萎病菌交配型的分析
　　收集交配型位點(diǎn)MAT1-1和 MAT1-2基因序列作為對(duì)照，將組裝的序列進(jìn)行Mapping，獲得不同類(lèi)型菌株的交配型基因，結(jié)果顯示香蕉枯萎病菌為異宗配合真菌，而Foc TR4（VCG01213,01216和01213/16）為MAT1-1類(lèi)型。
　?。?）香蕉枯萎病菌效應(yīng)蛋白的預(yù)測(cè)
　　根據(jù)結(jié)構(gòu)特征，預(yù)測(cè)了各測(cè)序菌株的效應(yīng)蛋白。結(jié)合公布在Broad Institut

7、e網(wǎng)站上的14種鐮刀菌基因組序列，利用比較基因組學(xué)方法鑒定到各VCGs特異的效應(yīng)蛋白，也對(duì)各生理小種特異的效應(yīng)蛋白進(jìn)行分析，鑒定到Foc Race1有24個(gè)、Foc STR4有47個(gè)、Foc TR4有37個(gè)。
　　2.Foc TR4侵染過(guò)程中效應(yīng)蛋白的表達(dá)規(guī)律
　　將Foc TR4接種廣粉1號(hào)、巴西蕉和抗病品種中蕉6號(hào)組培苗，將其侵染
　　過(guò)程分為附著、共生、共生向腐生轉(zhuǎn)化、腐生等4個(gè)階段。對(duì)侵染過(guò)程中表達(dá)的效應(yīng)蛋白進(jìn)

8、行鑒定。鑒定出的效應(yīng)蛋白的功能主要有：
　　①降解植物細(xì)胞壁：如果膠酶、纖維素酶、角質(zhì)酶、糖基水解酶等；
　　②結(jié)合自身細(xì)胞壁幾丁質(zhì)；
　?、奂?xì)胞自噬，參與香蕉枯萎病菌的形態(tài)建成；
　?、馨套饔茫?br>　?、萸宄闹麽尫诺腞OS；
　?、奁渌δ堋?br>　　3.Foc TR4重要效應(yīng)蛋白的功能分析
　　對(duì)前期Foc TR4接種巴西蕉組培苗的蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合比較基因組學(xué)鑒定結(jié)果，挑選1

9、07個(gè)效應(yīng)蛋白基因進(jìn)行研究，挑選標(biāo)準(zhǔn)為侵染過(guò)程中高表達(dá)或者Foc TR4特異效應(yīng)蛋白；研究?jī)?nèi)容包括：
　?。?）篩選壞死效應(yīng)蛋白；
　　（2）基因敲除，篩選對(duì)致病性影響較大的效應(yīng)蛋白。
　　壞死效應(yīng)蛋白的篩選：將挑選的效應(yīng)蛋白基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，再將表達(dá)的蛋白接種于香蕉組培苗葉片上，篩選到20個(gè)能引起HR反應(yīng)的效應(yīng)蛋白。
　　對(duì)致病性影響較大的效應(yīng)蛋白的篩選：對(duì)各個(gè)階段高表達(dá)的效應(yīng)蛋白，以及能使香蕉葉片產(chǎn)生

10、HR反應(yīng)的效應(yīng)蛋白進(jìn)行基因敲除，接種香蕉后，調(diào)查了發(fā)病率，結(jié)果如下：FOIG_00012，03734，07201敲除突變體完全喪失致病力；FOIG_01651，03512，03690，04451，07803，10415，01077，01919敲除突變體有弱致病力；FOIG_04525，07508，15400，15834敲除突變體有中度致病力，說(shuō)明這些效應(yīng)蛋白對(duì)病原菌的致病性有重要影響。
　　4.白僵菌素是Foc TR4一種重要的毒

11、性因子
　　本課題組的前期研究已經(jīng)表明：白僵菌素（BEA）能夠?qū)е录偾o腐爛、細(xì)胞死亡、香蕉幼苗的腐爛和死亡，轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果顯示BEA能夠抑制寄主DNA復(fù)制。為進(jìn)一步確定BEA對(duì)病原菌致病力的影響，構(gòu)建了BEA生物合成途徑的限速酶Bbeas的基因敲除突變體。測(cè)定了突變體的BEA生物合成和致病力變化，與野生型菌株相比較，Bbeas敲除突變體的BEA的生物合成量顯著降低，致病性完全喪失，而回補(bǔ)菌株Bbeas-complement能夠恢復(fù)B