β腎上腺素受體信號通路對嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞增殖與凋亡的調(diào)控作用.pdf

1、嬰幼兒血管瘤（infantile hemangiomas，IH）是一種十分常見的良性腫瘤，在新生兒中發(fā)病率可高達10％，以顏面部最為好發(fā)。常是在患兒出生時或出生后不久，皮膚上出現(xiàn)蚊咬狀紅點，并迅速增長，以3～4月時最為顯著。約有80％左右的血管瘤可以自行消退，另有20％左右稱為復(fù)雜性血管瘤，常生長在要害部位。在出生后頭幾周即開始系統(tǒng)性地運用皮質(zhì)類固醇類藥物，曾被認為是治療嬰幼兒血管瘤(IHs)的首選。研究發(fā)現(xiàn)，此類藥物可阻礙IH的進一步

2、增殖，但并不能誘導(dǎo)IH萎縮消退，因而僅對早期、處于增殖狀態(tài)的IH有效。雖然80％的IH發(fā)病于生后前6月，但許多患兒到醫(yī)院治療時往往已較晚，從而限制了皮質(zhì)類固醇類藥物的使用。此外，許多IH患兒、甚至是新生兒期的IH患兒對甾類藥物的治療并不敏感，同時此類藥物的副作用又非常明顯。二線治療藥物包括長春新堿與干擾素-α，但藥物的毒副作用仍然非常嚴重。
　　鹽酸普萘洛爾是非選擇性的β受體阻滯劑，大量的臨床病例研究已經(jīng)證實其對IH患兒有較好的療

3、效。最近，臨床隨機對照研究也證實鹽酸普萘洛爾運用于嬰幼兒及兒童局灶性及節(jié)段性IHs，療效肯定且毒副作用小。目前，有研究者已將普萘洛爾作為治療IH的一線藥物，而其它β受體阻滯劑如醋丁洛爾等也被運用于臨床治療，均取得了較好的療效。不過，β受體阻滯劑對IH的作用機制尚不明確。故本課題擬觀察β受體阻滯劑對體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細胞(HemECs)增殖與凋亡等生物學特性的影響，并深入探討β受體信號通路在調(diào)控過程中的作用及分子機制，從而為β受體阻滯劑

4、治療IH提供重要的理論依據(jù)，并為早期干預(yù)IH提供新的治療靶點。
　　第一部分普萘洛爾對血管瘤內(nèi)皮細胞增殖與凋亡的影響及其作用機制
　　目的：研究普萘洛爾對體外培養(yǎng)的嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細胞(HemECs)增殖、凋亡的影響及其作用機制。
　　方法：組織塊消化、流式分選嬰幼兒HemECs。采用Cell Counting Kit(CCK-8)法檢測細胞活性變化，BrdU標記法檢測細胞增殖狀態(tài)。采用AnnexinⅤ-FITC/PI

5、雙染流式細胞儀術(shù)與Hoechst33342熒光染色檢測觀察細胞凋亡情況。應(yīng)用western blot檢測VEGF、Caspase-3、Caspase-8及Caspase-9的表達，分光光度法檢測Caspase-8的相對活性，熒光定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因p53、Bcl-2、Bax及Bcl-xL的表達。
　　結(jié)果：與對照組相比，低劑量普萘洛爾(＜50μM/L)對HemECs的活性無明顯影響，而100μM/L普萘洛爾作用24小時能顯著

6、降低細胞活性至48％左右。100μM/L普萘洛爾作用24小時后，HemECs的增殖受到明顯抑制，細胞早期凋亡顯著增高，出現(xiàn)典型的凋亡細胞核形態(tài)學變化。普萘洛爾顯著抑制細胞內(nèi)VEGF的表達，激活凋亡蛋白Caspase-3與Caspase-9，但對Caspase-8活性無明顯影響。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)普萘洛爾干預(yù)后，凋亡相關(guān)基因p53與Bax表達量顯著升高、Bcl-xl表達量顯著下降，而Bcl-2基因表達量無顯著變化。
　　結(jié)論：普

7、萘洛爾對體外培養(yǎng)的HemECs具有明確的抗增殖、促凋亡作用，其機制可能為普萘洛爾能抑制HemECs中VEGF的表達，激活內(nèi)源性凋亡通路，上調(diào)促凋亡基因p53與Bax及下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-xL。
　　第二部分β受體信號通路對血管瘤內(nèi)皮細胞增殖的調(diào)控作用
　　目的：探討β受體信號通路對血管瘤內(nèi)皮細胞(HemECs)增殖的調(diào)控作用及其可能的機制。
　　方法：采用real time-PCR與western blot檢測β受

8、體在HemECs中的表達情況。選用β受體激動劑異丙腎上腺素(ISO)、選擇性β1受體阻斷劑美托洛爾(MET)及選擇性β2受體阻斷劑ICI118551(ICI)作用于體外HemECs。通過細胞增殖與活性實驗、流式細胞儀細胞周期分析，觀察ISO、MET及ICI對HemECs增殖的影響;采用酶聯(lián)免疫分析觀察細胞中cAMP水平變化;通過western blot檢測相關(guān)蛋白與磷酸化位點的變化。
　　結(jié)果：β1與β2受體在HemECs中均有表

9、達。與對照組相比，生理濃度(10nM/L)的ISO即能刺激HemEC增殖，在濃度達到1μM/L時作用最為明顯。同時，ISO能顯著促進cAMP的生成，但這種作用可被MET或ICI阻斷，其中以ICI作用更為明顯。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，ISO能顯著促進細胞周期蛋白D1、細胞周期蛋白依賴激酶-4(CDK-4)與CDK-6表達及Rb蛋白磷酸化。給予血管內(nèi)皮生長因子受體-2(VEGFR-2)抑制劑或細胞外信號調(diào)節(jié)酶(ERK)抑制劑能顯著

10、抑制ISO誘導(dǎo)HemEC增殖的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，β受體阻斷劑與VEGFR-2阻斷劑能顯著抑制ISO導(dǎo)致的ERK磷酸化。提前給予ICI能顯著抑制ISO誘導(dǎo)升高的VEGF表達與VEGFR-2活性，而MET無此作用。
　　結(jié)論：激活β受體可經(jīng)ERK通路促進HemEC的增殖;在β受體激活的同時，可反式激活VEGFR-2信號通路，從而進一步促進HemEC的增殖。
　　第三部分 VEGF-VEGFR-2自分泌環(huán)對血管瘤內(nèi)皮細胞凋亡影

11、響的分子作用機制
　　目的：VEGF-VEGFR-2信號通路在多數(shù)腫瘤中處于異常激活狀態(tài)，其對維持腫瘤的生物學特征中起著重要的作用。異常的VEGF-VEGFR-2信號通路可顯著促進血管瘤內(nèi)皮細胞(HemECs)的增殖與遷移，但對HemEC凋亡的影響尚無報道。故本研究擬對比HemEC與普通的臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)中VEGF-VEGFR-2活化狀態(tài)，探討其對細胞凋亡的影響與機制。
　　方法：無血清培養(yǎng)環(huán)境下誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞

12、凋亡。應(yīng)用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染流式細胞儀術(shù)、Hoechst33342與TUNEL熒光染色檢測觀察VEGF中和抗體與VEGFR-2阻斷劑對細胞凋亡的影響。采用western blot技術(shù)檢測VEGF、VEGFR-2及PTEN在HemEC和HUVEC中的表達或活化狀態(tài)。應(yīng)用PI3K與ERK抑制劑處理血管內(nèi)皮細胞，通過上述各種方法檢測VEGF-VEGFR-2信號通路抑制細胞凋亡的下游靶點。在獲得初步論證的基礎(chǔ)上，建立PTEN高

13、表達的HemEC系，檢測細胞凋亡狀態(tài)變化及其對Akt磷酸化的影響。
　　結(jié)果：無血清培養(yǎng)12h后，HUVEC可見凋亡率明顯較對照組增高，而HemEC凋亡率增高不明顯。無血清培養(yǎng)24h或48h，HemEC中出現(xiàn)增多的凋亡細胞，但顯著低于HUVEC。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)HemEC中VEGF表達水平與VEGFR-2磷酸化均顯著高于HUVEC，而PTEN表達水平顯著低于HUVEC。中和VEGF或阻斷VEGFR-2磷酸化后，He