miR-206以嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響及作用機(jī)制的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、嬰幼兒血管瘤(IH)是嬰幼兒最常見(jiàn)的良性腫瘤之一。該病的發(fā)病率約為3~10%,其中女性、白種人、低體重的早產(chǎn)兒、多胞胎、高齡產(chǎn)婦的嬰幼兒更易患病。根據(jù)病程的發(fā)展以及病理的變化,可以將IH分為增殖期、消退期、消退完成期。血管瘤的瘤體快速增長(zhǎng)期往往在出生后的前5個(gè)月,以伴有血管內(nèi)皮細(xì)胞的大量增殖為特點(diǎn)。大約10%的IH可以在1年內(nèi)自行完成退化,而余下的90%的IH則需要9~10年,甚至更長(zhǎng)的時(shí)間才能完全消退。IH為良性腫瘤,存在一定的自行消

2、退的傾向,但目前關(guān)于IH自行消退的機(jī)制尚不完全清楚。
  microRNA屬于小分子單鏈RNA,在真核細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控中有著廣泛的作用。前期對(duì)不同病程IH患兒的瘤體標(biāo)本進(jìn)行基因芯片分析,發(fā)現(xiàn):miR-206是IH病程中是表達(dá)差異最大的一個(gè)miRNA,其含量在病程發(fā)展過(guò)程中逐漸升高,消退完成期水平是消退期的24倍。這就提示miR-206可能是IH自發(fā)消退的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。
  轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGFβ)信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生

3、和血管生成中具有重要的調(diào)控作用。對(duì)于IH這一血管內(nèi)皮細(xì)胞源性腫瘤而言,TGFβ信號(hào)通路在病程的發(fā)展變化過(guò)程中起著重要作用。現(xiàn)研究表明:TGFβ在IH增生早期和消退晚期呈現(xiàn)弱表達(dá),而在增生中晚期和消退早期則表現(xiàn)為強(qiáng)表達(dá),提示TGFβ可能參與了IH血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的負(fù)向調(diào)控,并在瘤體自發(fā)消退過(guò)程中起到了促進(jìn)作用。然而,目前對(duì)TGFβ的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。
  基于以上考慮,本課題以miR-206和TGFβ信號(hào)通路為研究對(duì)象,探究二者

4、二者的關(guān)系,以及二者對(duì)嬰幼兒血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(HemEC)的影響,探究IH的消退機(jī)制。
  第一部分人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和嬰幼兒血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定
  實(shí)驗(yàn)?zāi)康?分離、純化、培養(yǎng)并鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和嬰幼兒血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞兩組細(xì)胞。
  實(shí)驗(yàn)方法:
  1.收集1 cm長(zhǎng)人臍帶標(biāo)本,人臍靜脈組織塊直接粘附于皿底原代培養(yǎng)10d,通過(guò)鏡下觀察爬出的細(xì)胞形態(tài),鑒別標(biāo)記出形態(tài)規(guī)則如鋪路石樣細(xì)胞及組織塊,挑

5、出目的組織塊,重新獨(dú)立貼壁培養(yǎng)約3~4d,收集獲得的細(xì)胞進(jìn)行傳代,擴(kuò)增,保存。
  2.收集獲取嬰幼兒血管瘤手術(shù)后標(biāo)本,通過(guò)血管瘤組織塊顆粒原代培養(yǎng)6~7d,將爬出的細(xì)胞收集、培養(yǎng)、傳代。待細(xì)胞量充足時(shí),通過(guò)CD31免疫磁珠進(jìn)行分選純化,得到嬰幼兒血管瘤來(lái)源的CD31表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞。
  3.將兩組細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)比較,并測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線以比較生長(zhǎng)特性。通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞Matrigel基質(zhì)膠成管實(shí)驗(yàn)、內(nèi)皮細(xì)胞乙酰低濃度脂蛋白

6、的攝取實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)及細(xì)胞表面抗體的流式檢測(cè)對(duì)組織塊法培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
  1.人臍靜脈組織塊法培養(yǎng)并依據(jù)鏡下形態(tài)分選純化獲得的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD31陽(yáng)性率達(dá)97%。
  2.增殖期嬰幼兒血管瘤組織塊培養(yǎng)法并經(jīng)過(guò)免疫磁珠分選獲得的HemEC,經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD31陽(yáng)性率達(dá)93.0%。
  3.兩種細(xì)胞內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)均為陽(yáng)性,生長(zhǎng)曲線測(cè)定顯示HemECs較H

7、UVEC的增殖能力更強(qiáng)。
  4.成管實(shí)驗(yàn)顯示HemEC較HUVEC具有更快的成管特性,較早出現(xiàn)管型,較早出現(xiàn)細(xì)胞聚集變化。
  5.細(xì)胞免疫熒光顯示兩組細(xì)胞CD31,CD105,VEGF,GLUT1,vWF均表達(dá)陽(yáng)性。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)論:證實(shí)通過(guò)收集的1cm人臍帶標(biāo)本,組織塊法培養(yǎng)經(jīng)細(xì)胞形態(tài)分選獲得的細(xì)胞,經(jīng)鑒定為HUVEC;通過(guò)收集增殖期嬰幼兒血管瘤組織標(biāo)本,組織塊法培養(yǎng)經(jīng)免疫磁珠分選獲得的細(xì)胞,經(jīng)鑒定為HemEC。細(xì)

8、胞分離純化的方法簡(jiǎn)便高效,獲得的細(xì)胞純度高,狀態(tài)好,數(shù)量充足。HemEC的增殖能力較HUVEC細(xì)胞更強(qiáng),HemEC的成管能力較HUVEC細(xì)胞更快。
  第二部分 miR-206對(duì)嬰幼兒血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響
  實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解miR-206對(duì)HemEC增殖和凋亡能力的影響。
  實(shí)驗(yàn)方法:
  1.轉(zhuǎn)染miR-206 mimics, miR-206 mimics NC, miR-206 inhibitor,

9、 miR-206inhibitorNC至HUVEC和HemEC中8h,通過(guò)倒置熒光顯微鏡拍照分析轉(zhuǎn)染效率。
  2.轉(zhuǎn)染后24h后,使用RT-PCR技術(shù),借助于Taqman探針和SYBR Green染料檢測(cè)各組細(xì)胞中的miR-206含量。
  3.通過(guò)CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HemEC的增殖能力。
  4.借助PI染料和AnnexinⅤ-FITC/PI染料,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-206對(duì)HemEC細(xì)胞周期的影響以及細(xì)

10、胞凋亡的影響。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
  1.轉(zhuǎn)染后的熒光分析顯示miR-206 mimics成功轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染效率高。
  2.TaqMan探針?lè)≧T-PCR檢測(cè)顯示miR-206 mimics轉(zhuǎn)染后miR-206的表達(dá)水平約是陰性對(duì)照組miR-206 NC的50000倍,顯著上調(diào)了HUVEC中的miR-206的表達(dá)水平;miR-206的表達(dá)水平約是陰性對(duì)照組miR-206 NC的7500倍,顯著上調(diào)了HemEC中的miR-2

11、06的表達(dá)水平。
  3.SYBR Green法RT-PCR檢測(cè)顯示miR-206 mimics轉(zhuǎn)染后,miR-206的表達(dá)水平約是陰性對(duì)照組miR-206 NC的70000倍,顯著上調(diào)了HUVEC中的miR-206的表達(dá)水平;miR-206的表達(dá)水平約是陰性對(duì)照組miR-206 NC的約100000倍,顯著上調(diào)了HemEC中的miR-206的表達(dá)水平
  4.CCK-8法檢測(cè)顯示miR-206轉(zhuǎn)染后的HemEC的細(xì)胞增殖活

12、性明顯下降,24h時(shí)miR-206抑制增殖能力最為顯著。
  5.細(xì)胞周期檢測(cè)顯示miR-206可使HemEC的S期比例下降,G2期比例增加。
  6.細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示miR-206使HemEC的凋亡比例變化不明顯。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)論:miR-206 mimics可顯著上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)miR-206的表達(dá)。提高miR-206的表達(dá)可有效抑制HemEC的細(xì)胞增殖,將細(xì)胞周期阻滯于G2期,但不能明顯誘導(dǎo)HemEC的凋亡。

13、  第三部分 miR-206抑制嬰幼兒血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖的機(jī)制研究
  實(shí)驗(yàn)?zāi)康?了解miR-206抑制嬰幼兒血管瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的機(jī)制。
  實(shí)驗(yàn)方法:
  1.通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù),分析miR-206具有調(diào)控作用的相關(guān)信號(hào)通路分析。
  2.通過(guò)Elisa法檢測(cè)miR-206轉(zhuǎn)染后HemEC后上清培養(yǎng)液中TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3以及BMP2、BMP4、BMP7的含量。
  3.借助于SY

14、BR染料,使用RT-PCR分析miR-206轉(zhuǎn)染HemEC后細(xì)胞內(nèi)的smad2、smad4、smad7基因的mRNA表達(dá)水平。
  4.通過(guò)Western-blot檢測(cè)miR-206轉(zhuǎn)染HemEC后smad2、pp-smad2、smad4、smad7蛋白表達(dá)水平。
  5.使用CCK-8法檢測(cè)TGFβ1對(duì)HemEC增殖能力的影響。
  6.通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)TGFβ1對(duì)HemEC細(xì)胞周期的影響。
  7.通過(guò)流式

15、細(xì)胞儀檢測(cè)不同濃度的TGFβ1對(duì)HemEC細(xì)胞凋亡的影響。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
  1.依據(jù)信號(hào)通路分析結(jié)果,結(jié)合miR-206可能的目標(biāo)通路,選擇TGF-betasignaling pathway作為研究對(duì)象。
  2.Elisa法檢測(cè)顯示miR-206 mimics轉(zhuǎn)染后HemEC分泌的TGFβ1的含量較陰性對(duì)照組miR-206 NC顯著提高,miR-206抑制劑轉(zhuǎn)染后HemEC分泌的TGFβ1含量較陰性對(duì)照組miR-

16、206 inhibitor NC顯著下降。
  3.RT-PCR檢測(cè)顯示上調(diào)HemEC中miR-206的表達(dá)可使smad7的基因表達(dá)顯著增多,下調(diào)HemEC中miR-206的表達(dá)可使smad7的基因表達(dá)明顯減少。
  4.Western-blot檢測(cè)顯示上調(diào)HemEC中miR-206的表達(dá)可使smad7的蛋白表達(dá)增多,下調(diào)HemEC中miR-206的表達(dá)可使smad7的蛋白表達(dá)減少。
  5.CCK-8法檢測(cè)顯示TGF

17、β1濃度越高,抑制HemEC增殖越顯著,同一濃度TGFβ1共培養(yǎng)的時(shí)間越長(zhǎng)抑制細(xì)胞增殖的能力越強(qiáng)。
  6.細(xì)胞周期檢測(cè)顯示TGFβ1可使HemEC的S期比例增加。
  7.細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示不同濃度TGFβ1使HemEC的凋亡比例變化不明顯。隨著TGFβ1濃度的升高,HemEC的凋亡比例微升,但HemEC的凋亡比例變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
  實(shí)驗(yàn)結(jié)論:提高HemEC細(xì)胞內(nèi)miR-206的表達(dá)可上調(diào)TGFβ1含量,上調(diào)sma

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