胎盤源性內(nèi)皮祖細(xì)胞始動(dòng)?jì)胗變貉芰霭l(fā)生發(fā)展的研究.pdf

1、研究背景：
　　嬰幼兒血管瘤(Infantile hemangioma，IH)是嬰幼兒最常見(jiàn)的良性腫瘤。新生兒發(fā)病率高達(dá)10-12％，約60%的病變發(fā)生于頭頸部，嚴(yán)重者可影響患兒容貌、受累器官功能、心理健康等。若不加以干涉治療，大多數(shù)IH患者在一歲內(nèi)快速增長(zhǎng)，之后在童年時(shí)慢慢退化為纖維脂肪組織。但約10%的IH由于其生長(zhǎng)過(guò)于迅速、面積過(guò)大或者生長(zhǎng)部位特殊，可能導(dǎo)致毀容、畸形、功能障礙甚至危及生命等。但目前IH特征性增殖、消退機(jī)制尚

2、未闡明，致使其臨床治療效果也不甚滿意。
　　目前關(guān)于IH的發(fā)生機(jī)制的探討，主要集中于血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的起源方面，其主要假說(shuō)有：遺傳和基因突變學(xué)說(shuō)、胎盤絨毛膜內(nèi)皮細(xì)胞學(xué)說(shuō)、干細(xì)胞學(xué)說(shuō)等，但目前仍未有一種學(xué)說(shuō)能夠很好闡明IH早期過(guò)度增生與后期自行消退的臨床特征。以往認(rèn)為IH是始動(dòng)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，但2008年Khan等首次報(bào)道從IH組織中提取出血管瘤干細(xì)胞后，證實(shí)IH中存在干細(xì)胞。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，剛分娩出的嬰幼兒若發(fā)現(xiàn)存在血管瘤，立即

3、取嬰幼兒血管瘤的胎盤組織（IHP），實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)組織中存在內(nèi)皮祖細(xì)胞，HE染色結(jié)果顯示，增生期IH與IHP的病理學(xué)組織形態(tài)相類似，而消退期IH組織中，未見(jiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的表達(dá)。血管內(nèi)皮祖細(xì)胞是干細(xì)胞的一種，能夠定向分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)具有自我更新、無(wú)限增殖、多向分化的能力，與增生期血管瘤臨床表現(xiàn)相似。
　　綜上所述，本課題推測(cè)：嬰幼兒血管瘤的血管增生，是血管內(nèi)皮祖細(xì)胞通過(guò)胎盤組織，動(dòng)員、遷移、定植并異常聚居于胚胎期的胎兒某個(gè)部位，在嬰

4、兒出生后，由于胎盤產(chǎn)生的生長(zhǎng)抑制因子被解除，在雌激素、各種細(xì)胞因子、特別是內(nèi)環(huán)境改變等因素的作用下，選擇性激活內(nèi)皮祖細(xì)胞，激活的內(nèi)皮祖細(xì)胞出現(xiàn)增殖，其絲足沿著促血管生長(zhǎng)因子分泌充足的地方遷移，形成血管分支，芽生的血管側(cè)枝吻合形成血管叢，導(dǎo)致血管瘤增生期，血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞大量增殖、血管快速新生（出生~1歲左右）；隨后在一系列信號(hào)通路的調(diào)控下，hEPCs逐漸分化為內(nèi)皮細(xì)胞后其自身表達(dá)逐漸減少，IH進(jìn)入相對(duì)靜止期(1歲后)，之后嬰幼兒體內(nèi)微環(huán)境

5、的改變導(dǎo)致血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞逐漸被纖維結(jié)締組織及脂肪組織所取代，從而產(chǎn)生特異性的消退期（5~10歲）；我們認(rèn)為這種推測(cè)血管瘤的發(fā)生、發(fā)展、消退符合IH臨床表現(xiàn)，解釋較為合理。
　　目前認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖，血管迅速生長(zhǎng)是IH病理組織學(xué)的最大特點(diǎn)。新生血管的生長(zhǎng)和發(fā)育是由一系列血管生長(zhǎng)因子通過(guò)許多信號(hào)通路完成的。傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為血管形成只存在于成體，而血管生成僅限于胚胎。隨著hEPCs在成體的分離成功，證明血管生成也發(fā)生于成體。因此，血管

6、形成、血管生成可能是人類血管新生的基本過(guò)程。hEPCs是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在形態(tài)學(xué)無(wú)法將hEPCs與其他細(xì)胞區(qū)分開(kāi)來(lái)，所以主要靠分子標(biāo)志識(shí)別。目前共識(shí)，CD34、CD133共同標(biāo)記的即為hEPCs。
　　那么，各種細(xì)胞因子、內(nèi)環(huán)境信號(hào)改變是如何來(lái)調(diào)控血管瘤的發(fā)生與發(fā)展的呢？目前，在其他腫瘤的研究中也發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞分泌的促血管生成因子和抑血管生成因子，共同調(diào)控血管的發(fā)生與血管的形成。血管的新生是由于血管內(nèi)皮細(xì)胞在血管

7、內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等許多細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，發(fā)生遷移和增殖，導(dǎo)致血管大量增生。 VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的促血管生成因子，是新生血管形成過(guò)程中的中心調(diào)控因子及血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性的有絲分裂原，多種腫瘤動(dòng)物模型研究已證實(shí)阻斷 VEGF信號(hào)通路能夠降低腫瘤微血管密度，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
　　有研究顯示DLL4/Notch信號(hào)通路過(guò)度表達(dá)，可產(chǎn)生非功能性血管，管腔纖細(xì)，血流明顯減少，導(dǎo)致腫瘤缺血、缺氧，從而抑制腫瘤增生。VEGF可誘

8、導(dǎo)DLL4表達(dá)，激活DLL4/Notch信號(hào)通路，提示VEGF對(duì)DLL4/Notch信號(hào)通路有正調(diào)節(jié)作用。而此信號(hào)通路的活化可減弱內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)VEGF誘導(dǎo)的血管新生反應(yīng)，提示其可能會(huì)反饋抑制VEGF信號(hào)通路的功能活性。因此，只有在VEGF和DLL4/Notch信號(hào)通路的協(xié)調(diào)作用下，血管瘤血管新生才能有序進(jìn)行。
　　目的
　　為進(jìn)一步研究證實(shí)上述猜想，本研究擬
　　1、在IH不同時(shí)期及IHP中，檢測(cè)CD34/CD133染標(biāo)

9、記的hEPCs的表達(dá)水平，證實(shí)增生期及IHP組織中hEPCs呈顯著性高表達(dá)，而消退期低表達(dá)或不表達(dá)，從而證實(shí)hEPCs與IH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，驗(yàn)證我們的推測(cè)，胎盤源性hEPCs始動(dòng)IH的發(fā)生發(fā)展。
　　2、在IH不同時(shí)期，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CD34、CD133、VEGF、DLL4的表達(dá)水平，探討VEGF-DLL4/Notch信號(hào)通路參與調(diào)控嬰幼兒血管瘤的血管新生。
　　方法：
　　1、收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院病理

10、科2014-2017年嬰幼兒血管瘤存檔蠟塊50例其中男22例，女28例，年齡1月～2歲、平均1.2歲，患者術(shù)前均未做任何輔助性治療。將所有標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)HE染色，免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)，按Mulliken分類標(biāo)準(zhǔn)并結(jié)合PCNA的表達(dá)進(jìn)行分組：石蠟標(biāo)本中增生期血管瘤26例，消退期血管瘤24例。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)IH增生期、消退期組織中第Ⅷ因子相關(guān)抗原(FⅧRAg)、VEGF、DLL4及CD34的表達(dá)水平。采

11、用HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文報(bào)告管理系統(tǒng)對(duì)VEGF和DLL4的表達(dá)進(jìn)行定量分析，并測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性反應(yīng)的平均光密度、陽(yáng)性反應(yīng)面積和所有細(xì)胞總面積。為下一步實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。
　　2、收集廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院婦產(chǎn)科2014-2017年出生后發(fā)現(xiàn)疑似血管瘤的新生兒，在產(chǎn)婦胎盤娩出30分鐘內(nèi)，在無(wú)菌操作下，切取胎盤葉狀絨毛膜部分。取材15例，常規(guī)HE染色后，鑒定符合嬰幼兒IHP者5例，例其中男3例，女2例，經(jīng)家屬同意后取

12、正常胎盤組織5例，作為陰性對(duì)照組。用免疫組化及免疫熒光法鑒定IHP及增生期IH組織中存在hEPCs，同時(shí)檢測(cè)CD34、CD133、DLL4的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1、通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：嬰幼兒血管瘤增生期組VEGF、DLL4、CD34的表達(dá)明顯高于消退期組和正常皮膚組(P＜0.05)，而后兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。VEGF表達(dá)陽(yáng)性血管瘤的MVD為37.6±1.6，VEGF表達(dá)陰性血管瘤的MVD為1

13、6.4±2.0，兩者差異具有顯著性差異（t=4.87，P＜0.01）。VEGF和DLL4陽(yáng)性面積率的相關(guān)性分析顯示, VEGF和DLL4在增生期及消退期IH組織中的表達(dá)均呈正相關(guān)，r=0.821，P=0.003；DLL4：r=0.830，P=0.003。
　　在IHP組織中，CD34，CD133以及DLL4主要定位于葉狀絨毛膜內(nèi)側(cè)，陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)彌漫分布的棕黃色顆粒，CD34，CD133及DLL4表達(dá)顯著。CD34，CD133及DL

14、L4陽(yáng)性率與陰性率相比，差異具有顯著性意義（P均＜0.01）。免疫熒光法鑒定時(shí)，CD34熒光染色時(shí)呈綠光，CD133呈紅光，雙染色顯著時(shí)呈黃色或黃綠色熒光，核染DAPI呈藍(lán)色，進(jìn)一步證實(shí)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　結(jié)論：
　　1.CD34、CD133、DLL4及CD34、CD133共同染色標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞在嬰幼兒血管瘤增生期及IHP組織中高表達(dá)，消退期及正常胎盤組織中低表達(dá)或不表達(dá)，提示內(nèi)皮祖細(xì)胞在嬰幼兒的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演重要角色