高糖激活VEGF受體和TNF受體共調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的增殖與凋亡信號通路的作用機制研究.pdf

1、本研究出發(fā)點和目的：針對該課題的研究方向，我們將著眼于介導VEC增殖和凋亡的兩條關(guān)鍵信號通路的共同調(diào)控作用，尋找它們之間可能存在的關(guān)聯(lián)，以及可能平衡這兩條信號通路的共調(diào)控關(guān)鍵位點。盡管現(xiàn)在有許多研究證明VEGFR2與TNFR1介導的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導對VEC的增殖和凋亡具有重要的調(diào)控作用，然而這兩條主要信號通路介導產(chǎn)生的生物信息傳遞是如何從生理應激狀態(tài)下的動態(tài)平衡轉(zhuǎn)化成病理生理狀態(tài)下的失平衡，最終導致VEC功能障礙和凋亡的具體機制目前尚未明

2、了。我們從許多血管受累性疾病的發(fā)病機制當中看到了它們發(fā)病機制中一個重要交匯點。我們希望以糖尿病和深靜脈血栓形成等臨床常見病作為切入點，探討VEGFR2與TNFR1介導信號通路共調(diào)控VEC增殖與凋亡的作用機制。本課題設(shè)計旨在通過體外和體內(nèi)實驗，包括體外培養(yǎng)細胞、構(gòu)建糖尿病和DVT動物模型來觀察研究VEC的病理生理改變，探索其內(nèi)在的機制，深入分析導致VEGFR2與TNFR1介導的細胞增殖和凋亡信號通路調(diào)控失平衡的可能因素。同時希望通過具有抗

3、氧化應激、抗炎作用的原花青素及其低聚物調(diào)控VEGFR和TNFR的失平衡來保護VEC。
　　 本課題研究內(nèi)容包括如下三部分：第一部分，高濃度葡萄糖損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞的機制研究;第二部分，結(jié)扎糖尿病大鼠腎下段下腔靜脈誘導深靜脈血栓形成與血管內(nèi)皮細胞損傷的作用及其機制研究;第三部分，原花青素及其低聚物治療糖尿病大鼠合并深靜脈血栓形成的初步研究。
　　 第一部分高濃度葡萄糖損傷人臍靜脈內(nèi)皮細胞的機制研究
　　 [目的]

4、探索高濃度葡萄糖損傷VEC的高糖時間和濃度效應，闡述VEGFR和TNFR共調(diào)控失衡是糖尿病血管并發(fā)癥和內(nèi)皮細胞損傷的重要因素，高糖對VEGFR通路和TNFR通路的調(diào)控影響內(nèi)皮細胞增殖和凋亡的作用。
　　 [材料與方法]以原代培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，分別用不同濃度的葡萄糖加入培養(yǎng)基中(5mmol/L，15mmol/L，30mmol/L，60mm

5、ol/L)，應用Griess化學發(fā)光法檢測一氧化氮(NO)；RT-PCR檢測內(nèi)皮性一氧化氮合酶(eNOS)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)基因表達；分子探針檢測ROS；western blot檢測蛋白eNOS，iNOS，VEGF，TNF-α，VEGFR2，p-AKT，RIP，TRADD，TRAF-2，F(xiàn)AP-1，PTEN和NF-κB；免疫熒光檢測NF-κB核內(nèi)轉(zhuǎn)移介導細胞凋亡；MTT法檢測內(nèi)皮細胞的活性試驗；Annexin-v-FITC

6、/PI雙標記流式細胞儀檢測細胞凋亡。
　　 [結(jié)果]高糖早期(24h)即升高HUVEC的NO、eNOS、VEGF、VEGFR2、TNF-α、ROS等表達。HUVEC在48h內(nèi)無明顯的細胞活性下降和細胞凋亡發(fā)生。然而隨著高糖的持續(xù)刺激，ROS的產(chǎn)生在72小時升高達到峰值，同時細胞內(nèi)表達iNOS，PTEN，RIP，TRADD，TRAF-2和NF-κB上調(diào)，而與抗細胞凋亡信號相關(guān)的因子NO、eNOS、p-AKT的表達明顯下調(diào)，MTT試

7、驗和流式細胞儀結(jié)果提示，在72-96h，高糖組的HUVEC開始出現(xiàn)明顯的細胞活性下降和細胞凋亡增加。
　　 [結(jié)論]高糖早期沒有引起HUVEC的凋亡和活性下降，然而隨著高糖時間的持續(xù)，氧化應激產(chǎn)生的氧自由基和細胞毒性物質(zhì)的積累，使VEGFR2介導的細胞增殖與TNFR1介導的細胞增殖和凋亡信號的平衡失調(diào)，最終導致HUVEC的功能障礙和細胞凋亡。
　　 第二部分結(jié)扎糖尿病大鼠腎下段下腔靜脈誘導深靜脈血栓形成與血管內(nèi)皮細胞損傷

8、的作用及其機制研究
　　 [目的]探討糖尿病(DM)合并深靜脈血栓形成(DVT)對血管內(nèi)皮細胞的損傷作用，觀察糖尿病合并靜脈血栓形成過程中VEC的VEGFR和TNFR共調(diào)控通路的失平衡，細胞因子和細胞粘附分子表達異常，以及可能加劇內(nèi)皮損傷的因素。
　　 [材料與方法]以Spraque-Dawley大鼠為研究對象，用STZ誘導建立糖尿病大鼠模型。正常飲食一個月后，按隨機原則分成5組(A：空白對照；B：下腔靜脈結(jié)扎(IVC-

9、ligated)；C：IVC-ligated+/低分子量肝素(LMWH)；D：DM+/IVC-ligated；E：DM+/IVC-ligated+/LMWH)，B～E組大鼠均予以腎下段IVC結(jié)扎建立DVT模型。通過測量血栓大小，在電鏡下觀察內(nèi)皮細胞形態(tài)學變化，應用免疫組化、免疫熒光、western blot，ELISA檢測VEGFR2、TNFR1、CD34、vWF、IL-6、TNF-α和ICAM-1的表達。
　　 [結(jié)果]結(jié)扎腎

10、下IVC可導致糖尿病大鼠快速形成深靜脈血栓，我們觀察到血栓形成早期即可有靜脈內(nèi)皮細胞的脫落和壞死。同時伴隨著靜脈內(nèi)皮細胞的VEGFR2，CD34表達下調(diào)，TNFR1，vWF表達上調(diào)；血清細胞因子IL-6和TNF-α釋放增加；血栓的ICAM-1表達上調(diào)。
　　 [結(jié)論]持續(xù)高糖損害內(nèi)皮細胞，內(nèi)皮功能障礙可能是合并靜脈血栓形成和血栓性炎癥反應的主要原因之一，血栓形成又進一步加劇血管損傷。
　　 第三部分原花青素及其低聚物治療

11、糖尿病大鼠合并深靜脈血栓形成的初步研究
　　 [目的]應用原花青素及其低聚物治療糖尿病大鼠合并深靜脈血栓形成。探索原花青素及其低聚物的抗血栓形成作用。
　　 [材料與方法]以第二部分的動物模型構(gòu)建和分組為基礎(chǔ)，添加葡萄籽原花青素提取物(GSPE)400mg/Kg/d灌胃治療組。通過測量血栓大小，在電鏡下觀察內(nèi)皮細胞形態(tài)學變化，應用免疫組化、免疫熒光、western blot，ELISA檢測VEGFR2、CD34、vWF、

12、ADAMTS13、IL-6、TNF-α、P-選擇素、VCAM-1和ICAM-1的表達。
　　 [結(jié)果]GSPE減少血栓形成，保護內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)的完整性，上調(diào)內(nèi)皮細胞的VEGFR2、CD34、ADAMTS13表達，下調(diào)vWF、IL-6、TNF-α、P-選擇素、VCAM-1和ICAM-1的表達。
　　 [結(jié)論] GSPE具有抗血栓形成的作用。其作用機制可能在于保護內(nèi)皮細胞，減少血小板激活和凝集，減少白細胞粘附損害靜脈內(nèi)皮細胞，