登革病毒誘導血管內皮細胞凋亡死亡受體信號轉導通路的研究.pdf

1、背景：登革病毒(Dengue virus，DEN)屬黃病毒科蚊媒病毒，有4個血清型，可引起人類登革熱(dengue fever，DF)、登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)。據(jù)報導，目前全球約25億人口受到登革病毒感染的威脅[1]。 DHF/DSS最明顯的特征是血漿滲漏和全身出血，提示血管的病變與疾病的嚴重程度密切相關。但DH

2、F/DSS發(fā)病機制尚未完全清楚，尤其是血管滲漏綜合癥有關的內皮細胞功能損傷的發(fā)牛機制不明。早期的研究認為，抗體依賴增強作用(ADE)是第二次異源性登革病毒感染誘發(fā)DHF/DSS的主要原因[2-4]；而病毒的變異也與登革感染的嚴重程度有關[5-7]；有報道認為，登革病毒的直接作用以及登革病毒感染引起的免疫病理損傷參與了致病[8-10]；而目前越來越多的證據(jù)表明登革病毒感染誘導的宿主細胞凋亡可能在DHF/DSS中起著重要的作用[11-13]

3、。 病毒感染可導致宿主靶細胞凋亡，死亡受體(death receptors，DRs)介導的途徑是一條重要的凋亡調控途徑。DRs，屬于腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)受體超家族，是Ⅰ型膜蛋白，具有一個富含半胱氨酸的胞外結構域和一個同源的胞漿序列-死亡結構域(Death Domain，DD)。DRs結合同源配體后，通過DD募集其下游誘導凋亡的效應分子，引起一系列Caspase的活化，從而引起凋亡[1

4、4]。目前與病毒感染密切相關的DRs主要包括Fas(CD95)、腫瘤壞死因子受體(TNFR)、TNF相關誘導配體(TNF-related apoptosis inducing ligand，TRAIL)受體TRAILR。 Fas(CD95)是FasL的受體，機體中許多組織細胞都可表達[15]。配體化的Fas能通過其DD與細胞內的轉接蛋白FADD(Fas-associated death domain protein)相互作用。FADD通

5、過死亡效應區(qū)(Death Effector Domain，DED)與procaspase-8結合，形成死亡誘導信號復合物(DISC，death-inducing signaling complex)，它能導致procaspase-8蛋白水解并自我激活。caspase-8的活化又能引發(fā)caspase激活的級聯(lián)反應，激活caspase-3等效應分子，導致細胞核的形態(tài)變化，引起細胞凋亡。Fas介導的凋亡在CTL殺病毒感染的細胞、去除激活的T細

6、胞及藥物治療腫瘤過程中發(fā)揮了重要的作用。有報道[16-19]，由Fas介導的細胞凋亡在脈管系統(tǒng)牛理或病理性的細胞更新過程中發(fā)揮了一定的作用。另據(jù)報道[20]，F(xiàn)as系統(tǒng)參與了暴發(fā)性乙型肝炎的發(fā)病。 TRAIL能誘導大多數(shù)腫瘤細胞凋亡，在病毒與宿主細胞相瓦作用中也起著重要的作用[21-24]。TRAIL受體包括5種，其中兩種死亡受體——RAILR1(DR4)、TRAILR2(DR5)，能誘導多數(shù)腫瘤細胞或轉化細胞凋亡；兩種“誘騙”

7、受體(decoy receptor)——TRAILR3(DcR1)、TRAILR4(DcR2)，由于缺乏胞漿內完整的DD，不能介導凋亡，正常細胞通過這兩種受體與TRAILR1和TRAILR2競爭結合TRAIL而免受凋亡；一種可溶性的受體——OPG(osteoproteoprotegerin)，能清除體內的TRAIL。TRAIL的致凋亡作用與細胞表面的TRAIL死亡受體(TRAILR1、TRAILR2)的高表達及TRAIL誘誀受體(TRA

8、ILR3、TRAILR4)的低表達有關。越來越多的研究表明：TRAIL受體介導的細胞凋亡與病毒感染有關[25-26]。據(jù)Matsuda的報道[27]：登革病毒感染誘導肝細胞凋亡的實驗中，TRAIL/TRAILR是一對重要的凋亡媒介分子。 TNFR主要包括TNFR1和TNFR2，也可參與細胞凋亡調控途徑[28]，其配體主要是感染活化的巨噬細胞和T細胞產生的TNF-α[29]。TNFR1和TNFR2的生物學功能不是獨立的，許多牛物學

9、活性由兩者共同完成。 登革病毒可以損傷人類不同組織的血管內皮細胞(vessel endothelial cells，VECs)[30]，但登革病毒對VECs凋亡的影響及可能的凋亡通路尚未有確切報道。由于目前尚無理想的登革病毒損傷血管內皮的動物模型，體外實驗就成為探討DHF/DSS中血管內皮細胞損傷機制的重要途徑。本實驗用了三種不同來源的VECs來研究登革病毒對血管內皮細胞的致凋亡作用，比較其DRs的表達，并進一步檢測凋亡信號轉導

10、通路中caspase系列凋亡相關蛋白的變化，這有助于進一步揭示登革病毒感染致宿主細胞凋亡的分子機制，并為DHF/DSS中血漿滲漏和出血的發(fā)病機制提供一定的參考依據(jù)。目的本研究旨在明確參與DEN-2引發(fā)血管內皮細胞凋亡的DRs及其凋亡信號轉導通路。 方法 (1)DEN-2的擴增與定量：采用C6/36細胞進行病毒擴增，病毒蝕斑實驗定量。 (2)人臍靜脈血管內皮細胞株(ECV304)、人肝靜脈血管內皮細胞株(ED25)

11、的培養(yǎng)：常規(guī)貼壁細胞培養(yǎng)法。 (3)原代分離的人臍靜脈血管內皮細胞(HUVEC)細胞分離、培養(yǎng)、鑒定：取新鮮臍帶分離、培養(yǎng)原代HUVEC。采用形態(tài)學、Ⅷ因子抗原免疫組織化學技術鑒定所分離的細胞。用生長穩(wěn)定，形態(tài)良好的第二至第四代細胞進行試驗。 (4)細胞凋亡實驗：用Annexin-V-FITC和7-ADD(7-氨基放線菌素D)標記，流式細胞技術(FACS)檢測細胞凋亡。 (5)DRs及FasL的檢測：用單克隆抗體

12、對細胞進行表面標記染色，F(xiàn)ACS技術檢測病毒作用前、后血管內皮細胞DRs及FasL的表達。 (6)凋亡阻斷實驗：在DEN-2感染細胞的同時，加入caspase阻斷劑與細胞共培養(yǎng)，檢測阻斷后細胞凋亡百分比的變化。 (7)Western Blot：免疫印跡法檢測DEN-2感染前、后細胞內活化caspase-8和caspase-3的變化。 (8)統(tǒng)計方法：實驗結果采用SAS 8.1軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析。 結果

13、 (1)DEN-2感染后ECV304、ED25兩株細胞細胞凋亡數(shù)及細胞表達Fas百分比均增加(P<0.05)；而TRAILR1-4，TNFR1-2表達水平甚低，且感染前、后無明顯改變。 (2)DEN-2感染后HUVEC細胞凋亡數(shù)增加，凋亡的數(shù)量隨時間的延長而有增高趨勢；但在同一時間、不同滴度(m．o．i．=0.04，0.4，4，40)的DEN-2感染HUVEC，凋亡數(shù)未見明顯差別。 (3)DEN-2感染后HUVE

14、C細胞表達Fas百分比增加，P<0.05；HUVEC的TRAILR1、TNFR1-2表達水平甚低，且感染前、后無明顯改變；TRAILR2-4有表達(10％-28％)，感染后呈降低趨勢。 (4)HUVEC細胞表達FasL百分比為7.5％-11.5％，DEN-2感染前、后無明顯差別。 (5)DEN-2感染后，caspase3、6、8、9阻斷劑能一定程度降低HUVEC的凋亡百分比。 (6)Western Blot結果觀

15、察到DEN-2感染后，HUVEC出現(xiàn)磷酸化的caspase8和caspase 3條帶。 結論 (1)DEN-2能誘導血管內皮細胞ECV304、ED25、HUVEC產生細胞凋亡。 (2)DEN-2感染前，ECV304、ED25兩細胞系與新鮮分離的原代HUVEC細胞表達DRs不一致。 (3)DEN-2感染后，三種VECs(ECV304、ED25、HUVEC)細胞表達Fas百分比均顯著高于感染前。 (4