α-,1D-腎上腺素受體自身抗體致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙及T淋巴細(xì)胞增殖的作用.pdf

1、背景：
　　 高血壓(Hypertension,HT)是一種以動脈血壓升高為主要特征的全身性疾病，是目前臨床上最常見、最重要的心血管疾病之一。雖然目前在高血壓的發(fā)病機制和治療方面已經(jīng)取得了巨大的成就，但仍有很多患者的血壓得不到理想的控制，提示在高血壓發(fā)生發(fā)展過程中可能還有其它因素的參與。
　　 近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在惡性高血壓、原發(fā)性高血壓和難治性高血壓患者血清中存在有針對α1-腎上腺素受體細(xì)胞外第二環(huán)(α1-AR-ECⅡ

2、)的自身抗體(α1-AA)，該自身抗體可以使培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞搏動頻率加快，使心肌細(xì)胞膜上L-鈣通道激活。此外，我們的前期工作還觀察到α1-AA可以通過激活α1-腎上腺素受體增加離體大鼠胸主動脈的張力和重要臟器微血管的張力。這些研究強烈提示α1-AA可能與高血壓疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但目前的研究主要聚焦于α1A受體的自身抗體(α1A-AA)，而α1-腎上腺素受體(α1-AR)主要分為α1A、α1B、α1D三種亞型。已有研究發(fā)現(xiàn)，在人和

3、大鼠主動脈分布的α1-AR亞型主要是α1D-AR，α1D對大動脈及小動脈收縮都起重要作用，參與了高血壓的發(fā)生發(fā)展，所以高血壓患者體內(nèi)α1D受體自身抗體(α1D-AA)的有無及其與疾病的關(guān)系值得關(guān)注。但目前要解決上述問題尚需要完成大量的基礎(chǔ)研究工作。首先，已有的檢測α1-AA的試劑盒是用于檢測抗α1A-AR自身抗體的。因此，建立一種針對α1D-AR亞型自身抗體的檢測試劑盒，是進(jìn)行α1D-AA研究所必備的基礎(chǔ)條件。其次，α1D-AA的病理生

4、理意義有待進(jìn)一步確定。本研究小組前期用合成的α1D-AR-ECⅡ肽段主動免疫正常大鼠，雖然并未導(dǎo)致高血壓形成，免疫大鼠的血管內(nèi)皮功能發(fā)生了損傷。然而，這種血管內(nèi)皮功能損傷并不能區(qū)別是由于抗原本身的作用，還是由α1D-AA所引起。此外，高血壓發(fā)病過程中存在免疫系統(tǒng)激活的現(xiàn)象，但原因不清。已知T淋巴細(xì)胞在免疫應(yīng)答起始階段起著必不可少的輔助作用，T淋巴細(xì)胞增殖是機體對抗原刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答過程中的一個重要階段。有研究表明，T淋巴細(xì)胞膜上存在α1

5、D-AR，那么，α1D-AA除了先前所發(fā)現(xiàn)的對心血管的作用外，是否可以與T淋巴細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而影響機體的免疫調(diào)節(jié)功能呢?
　　 為了回答上述問題，我們設(shè)計了本研究課題：(1)根據(jù)ELISA方法的原理，設(shè)計和研制針對高血壓患者α1D-AA的抗體測定試劑盒；(2)將α1D-AA轉(zhuǎn)運至正常大鼠，檢測前期研究觀察到的α1D-AR-ECⅡ主動免疫大鼠造成的血管內(nèi)皮損傷等現(xiàn)象是否由α1D-AA所引起；(3)制備高血壓大鼠模型，檢

6、測模型鼠免疫狀態(tài)，并從離體水平觀察α1D-AA對T淋巴細(xì)胞的直接作用。
　　 目的：
　　 1.建立并優(yōu)化檢測α1D-AA的間接酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定方法和條件。
　　 2.觀察α1D-AA長期被動免疫對大鼠的血壓和血管內(nèi)皮的損傷情況。
　　 3.觀察α1-AA是否可以與T淋巴細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而影響機體的免疫調(diào)節(jié)功能?
　　 研究方法
　　 1.以合成的人α1D-腎上腺素

7、受體(α1D-adrenoceptor,α1D-AR)細(xì)胞外第二環(huán)功能表位肽段(第192-218位氨基酸殘基)為特異性抗原，建立間接ELISA測定方法，并用該法檢測100例血壓正常者和69例原發(fā)性高血壓患者血清中抗α1D-AA。
　　 2.用α1D-AA長期被動免疫正常大鼠，觀察該類抗體對大鼠血壓的直接影響；通過血管環(huán)張力測定技術(shù)，觀察α1D-AA長期存在下，大鼠離體胸主動脈血管舒縮活動的改變；以血清中內(nèi)皮素-1(ET-1)含量

8、為指標(biāo)，觀察在該抗體長期作用下，血管內(nèi)皮的損傷情況。
　　 3.采用兩腎一夾(2K1C)法制備高血壓大鼠模型，模型成功后，定期檢測血清中α1D-AA的抗體滴度；并檢測抗體生成能力；培養(yǎng)腸系膜淋巴結(jié)細(xì)胞，采用CCK-8檢測試劑盒，觀察α1D AA對刀豆球蛋白A(Concanavalin A,Con A)刺激的T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.α1D-AA試劑盒的建立及初步應(yīng)用
　　 該實驗

9、方法中確定的最適抗原工作濃度為2.5mg/L，生物素化山羊抗人IgG的工作濃度為1∶1500，SA-HRP的工作濃度為1∶750。
　　 用我們建立的試劑盒，將α1D-AA陽性對照血清和陰性對照血清重復(fù)測定20次，其批內(nèi)變異系數(shù)分別為5.8％和4.2％；連續(xù)測定20天的批間變異系數(shù)分別為12.7％和9.8％，提示本方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
　　 特異性吸收試驗結(jié)果表明(圖1-1)，以人工合成的α1D-AR細(xì)胞外第二

10、環(huán)相應(yīng)的抗原肽段吸收陽性血清后，使平均OD值下降了2/3；而使用PMT吸收陽性血清后，沒有使該抗體水平下降。提示，本法具有較強的特異性。
　　 用該試劑盒測定原發(fā)性高血壓患者血清中α1D-AA，其陽性率為23.2％(16/69)，明顯高于血壓正常者血清的陽性率9％(9/100)，(P＜0.05，表1-2)。
　　 2.被動免疫正常大鼠后α1D-AA抗體滴度的變化
　　 給正常大鼠經(jīng)尾靜脈被動轉(zhuǎn)入α1D-AA后，大

11、鼠血清中α1D-AA水平迅速升高，隨后保持在一個較平穩(wěn)的水平。被動免疫組1、2、3、4月之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異，但和對照組相比均有顯著差異(均為P＜0.05)。在整個被動免疫過程中，免疫大鼠血清中α1D-AA水平維持在0.43±0.13～0.49±0.11之間，提示α1D-AA被動免疫模型制備成功(圖2-1)。
　　 3.被動免疫正常大鼠后血壓的變化
　　 被動免疫之前大鼠免疫組和對照組的平均血壓分別為105±5.4mmH

12、g和104±4.4mmHg，兩者相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞.05)。第2周時免疫組大鼠血壓有所升高，第4周時血壓一過性升高達(dá)125±6.9mmHg，明顯高于免疫對照組(P＜0.05)，并維持到第6周(125±7.3mmHg)，隨后血壓回落到被動免疫前的水平。而免疫對照組大鼠血壓在整個免疫過程中無明顯變化(圖2-2)。
　　 4.被動免疫正常大鼠血清中ET-1的變化
　　 采用ELISA法定量測定大鼠血清中ET-1的含量。研究

13、結(jié)果顯示，被動免疫組大鼠在免疫后4周血清中ET-1含量便開始增高(12.0±1.4)，12周時達(dá)高峰(21.0±1.6)，與對照組(11.0±1.1)相比有顯著性差異(P＜0.05)。至免疫結(jié)束時，免疫組ET1仍保持在較高的水平(16.3±0.6)，(P＜0.05，vs.同期對照組，圖2-3)。提示α1D-AA可能持續(xù)地引起了血管內(nèi)皮損傷。
　　 5.被動免疫正常大鼠血管反應(yīng)性的變化
　　 采用離體血管環(huán)的方法測定大鼠胸

14、主動脈的舒縮功能。研究結(jié)果顯示，隨著去氧腎上腺素(PE)濃度的升高，離體大鼠胸主動脈血管環(huán)的收縮幅度逐漸增加，在PE濃度為10-7mol/L和10-6mol/L時，被動免疫組大鼠的血管收縮作用較對照組均增強，兩組相比有顯著性差異(P均小于0.05，圖2-4)；盡管如此，被動免疫組大鼠胸主動脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能卻弱于免疫對照組，當(dāng)Ach濃度為10-6mol/L和10-5mol/L時，兩組大鼠的血管舒張程度均有顯著性差異(P＜0.05，

15、P＜0.05，圖2-5)。
　　 6.2K1C手術(shù)后大鼠血壓的變化情況
　　 2K1C手術(shù)前手術(shù)組和偽手術(shù)組的血壓分別為114.8±3.9 mmHg和114.3±3.3mmHg；手術(shù)2周后手術(shù)組大鼠血壓升高(134.3±8.7mmHg)，顯著高于同期偽手術(shù)組(116.2±3.9mmHg)(兩組相比P＜0.05)；在術(shù)后4周時手術(shù)組大鼠血壓達(dá)到高峰(141.5±10.5mmHg)，(P＜0.01，vs.同期對照組)；并且在

16、術(shù)后16周時手術(shù)組大鼠血壓仍維持在較高水平(137.6±7.4mmHg，P＜0.01，vs.同期偽手術(shù)組，圖3-1)。提示，高血壓模型制備成功。
　　 7.2K1C手術(shù)后大鼠血清中α1D-AA的生成
　　 2K1C手術(shù)后2周手術(shù)組大鼠血清中α1D-AA含量即升高(0.19±0.02)，顯著高于偽手術(shù)組(0.15±0.01，P＜0.01)；4周后手術(shù)組大鼠血清中α1D-AA含量達(dá)到高峰(0.21±0.01，P＜0.01，v

17、s.同期偽手術(shù)組)；并持續(xù)到第12周(0.21±0.01，P＜0.01，vs.同期偽手術(shù)組)，之后開始下降，并于術(shù)后16周降至術(shù)前水平(0.16±0.01，圖3-2)。提示，在高血壓形成過程中有α1D-AA的生成，并呈一定的規(guī)律性。
　　 8.高血壓大鼠模型中抗體生成能力的改變
　　 采用直接溶血空斑實驗來測定兩周時2K1C大鼠脾淋巴細(xì)胞的功能(即抗體生成能力)，結(jié)果表明，2K1C大鼠直接溶血空斑數(shù)量明顯升高(2.5±0

18、.01，P＜0.01，vs.偽手術(shù)組，圖3-3)。提示，2K1C術(shù)后大鼠在血壓升高過程中出現(xiàn)免疫系統(tǒng)抗體生成能力的增強。
　　 9.α1D-AA對T淋巴細(xì)胞增殖功能的影響
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究建立的α1D-AA檢測的間接ELISA方法具有較強的特異性以及良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
　　 2.α1D-AA被動免疫大鼠，可以引起大鼠血壓一過性的升高，但并不能導(dǎo)致高血壓的形成。而該抗體長期存在時，可以導(dǎo)