新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞分化的分子機(jī)制及微環(huán)境的初步研究.pdf

1、在成年哺乳動(dòng)物耳蝸中，聽覺毛細(xì)胞和神經(jīng)元在損傷后不能自然再生，這是感音神經(jīng)性聾的主要原因。近年來，成功從新生鼠耳蝸分離出耳蝸前體細(xì)胞，也有人稱之為耳蝸干細(xì)胞，在體外培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞能分化為毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元樣細(xì)胞。研究耳蝸前體細(xì)胞的分化機(jī)制及微環(huán)境將為誘導(dǎo)損傷后毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元再生提供依據(jù)。我們通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)分子cyclinA2和CRP2可能參與了耳蝸的發(fā)育以及前體細(xì)胞的增殖、分化。
　　實(shí)驗(yàn)一新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞的

2、分離、培養(yǎng)
　　目的：對(duì)新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)。
　　方法:從P2大鼠耳蝸分離培養(yǎng)前體細(xì)胞，血清誘導(dǎo)分化后用免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定多向分化潛能，通過掃描電鏡觀察分化細(xì)胞表面的超微結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步了解分化細(xì)胞的特性。
　　結(jié)果:原代培養(yǎng)的細(xì)胞第3天即可見“細(xì)胞球”，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，可見細(xì)胞球體積增大。細(xì)胞球內(nèi)絕大部分細(xì)胞呈nestin和BrdU陽性，表明其具有自我更新的能力。細(xì)胞球經(jīng)誘導(dǎo)分化14d后，對(duì)分化細(xì)胞

3、行免疫熒光化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)部分細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物myosinVIIA，部分細(xì)胞表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP或者成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NeuN，證明其具有多向分化潛能。掃描電鏡下可見扁平的三角形或不規(guī)則形細(xì)胞，表面具有纖毛樣結(jié)構(gòu)，其纖毛頂端的結(jié)構(gòu)與正常耳蝸毛細(xì)胞纖毛頂端相似，此外還可見雙極神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞。
　　結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)為研究耳蝸前體細(xì)胞的分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)二cyclinA2在大鼠耳蝸組織發(fā)育和耳蝸前體細(xì)胞分化過

4、程中的表達(dá)變化
　　目的:細(xì)胞周期分子cyclinA2具有調(diào)控G1/S轉(zhuǎn)換和G2/M轉(zhuǎn)換的雙重作用。目前對(duì)于cyclinA2在內(nèi)耳中的功能尚未見任何報(bào)道。我們擬通過檢測(cè)cyclinA2在大鼠耳蝸組織發(fā)育及耳蝸前體細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況，探討其是否參與了哺乳動(dòng)物耳蝸的發(fā)育。
　　方法:一、cyclinA2在大鼠耳蝸組織發(fā)育過程中的表達(dá)情況：P2、P10和P42的SD大鼠取耳蝸組織，RT-PCR、Westernblot和免疫組

5、織化學(xué)染色的方法檢測(cè)cyclinA2的表達(dá)。二、cyclinA2在大鼠耳蝸前體細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況：用RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色和Westernblot的方法檢測(cè)cyclinA2在未分化、分化6天及分化14天耳蝸前體細(xì)胞的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:cyclinA2表達(dá)于P2大鼠耳蝸的螺旋緣，在P10后的耳蝸未見表達(dá)。在前體細(xì)胞的分化過程中cyclinA2的表達(dá)量逐漸下降。
　　結(jié)論:在大鼠耳蝸組織發(fā)育及耳蝸前體細(xì)胞分化的

6、過程中cyclinA2表達(dá)量逐漸下降，這表明cyclinA2可能參與了大鼠出生后耳蝸的發(fā)育。
　　實(shí)驗(yàn)三CRP2及CRIP2在大鼠耳蝸組織發(fā)育和耳蝸前體細(xì)胞分化過程中的表達(dá)變化
　　目的:我們實(shí)驗(yàn)室在以往研究中通過RT-PCR及Westernblot首次證實(shí)LIM分子CRP2及CRIP2表達(dá)于大鼠的內(nèi)耳。其中CRP2表達(dá)于胚胎期耳蝸，在成年耳蝸中無表達(dá)；而CRIP2在不同年齡耳蝸中（包括胚胎期）表達(dá)量無明顯差異。為進(jìn)一步探討

7、CRP2及CRIP2是否參與了哺乳動(dòng)物耳蝸的發(fā)育，我們擬通過免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)的方法檢測(cè)CRP2及CRIP2在不同年齡大鼠耳蝸組織中的分布及耳蝸前體細(xì)胞分化前后的表達(dá)變化。
　　方法:一、CRP2及CRIP2在大鼠耳蝸組織發(fā)育過程中的表達(dá)情況：免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)其在P2、P6和P10大鼠耳蝸中的表達(dá)。二、CRP2及CRIP2在大鼠耳蝸前體細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況：用免疫細(xì)胞化學(xué)染色的方法檢測(cè)其在未分化和分化7天耳蝸

8、前體細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:免疫組化結(jié)果顯示，CRP2主要表達(dá)于螺旋神經(jīng)節(jié)，并且在耳蝸發(fā)育過程中，其陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少。CRIP2主要表達(dá)于耳蝸組織中的螺旋神經(jīng)節(jié)、螺旋緣和Corti器，而且在P2、P6和P10各組中陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯差異。另外，在P2組前庭的感覺上皮部位也可見CRIP2和CRP2的表達(dá)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示，CRIP2和CRP2均可表達(dá)于未分化的前體細(xì)胞，在胞核和胞質(zhì)中均呈陽性表達(dá)，CRIP2可表達(dá)于分化7

9、天細(xì)胞的胞質(zhì)。分化細(xì)胞未見CRP2的表達(dá)。
　　結(jié)論:CRP2可能參與了耳蝸的發(fā)育以及毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元的增殖；CRIP2在耳蝸不同發(fā)育時(shí)期以及前體細(xì)胞分化前后均穩(wěn)定表達(dá)，表明其可能在維持耳蝸細(xì)胞基本功能中發(fā)揮一定作用。
　　實(shí)驗(yàn)四耳蝸前體細(xì)胞分化的微環(huán)境對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化影響的初步研究
　　目的:耳蝸前體細(xì)胞向毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元定向分化的具體機(jī)制尚不清楚，前體細(xì)胞所處的微環(huán)境在分化過程中起重要作用。為探討微環(huán)境在細(xì)胞分

10、化中的作用，我們?cè)隗w外將GFP標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞和耳蝸前體細(xì)胞按比例混合，并誘導(dǎo)其分化，觀察耳蝸前體細(xì)胞分化的微環(huán)境對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響。
　　方法:將耳蝸前體細(xì)胞和GFP標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞按10:1的比例混合后接種于同一培養(yǎng)皿中，誘導(dǎo)分化后進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。21天后采用免疫熒光的方法對(duì)分化細(xì)胞進(jìn)行鑒定。一抗采用抗myosinVIIA（毛細(xì)胞標(biāo)志物）和抗peripherin（神經(jīng)元標(biāo)志物）。
　　結(jié)果:耳蝸前體細(xì)胞分化的微環(huán)境促進(jìn)

11、神經(jīng)干細(xì)胞的存活，并誘導(dǎo)其向myosinVIIA陽性細(xì)胞及雙極神經(jīng)元形態(tài)細(xì)胞分化。
　　結(jié)論:耳蝸前體細(xì)胞的成功分離、培養(yǎng)為研究其分化的機(jī)制提供了一個(gè)極佳的體外模型，對(duì)于耳蝸前體細(xì)胞分化的微環(huán)境需要更加深入的研究。
　　實(shí)驗(yàn)五干細(xì)胞向雛雞和成年豚鼠耳蝸移植方法的建立
　　目的:研究耳蝸前體細(xì)胞分化的機(jī)制，目的是誘導(dǎo)外源性干細(xì)胞定向分化為聽覺毛細(xì)胞及神經(jīng)元，或刺激體內(nèi)內(nèi)源性耳蝸前體細(xì)胞再生，從而修復(fù)受損的聽覺細(xì)胞。將外源

12、性干細(xì)胞或治療基因表達(dá)載體（如腺病毒等）植入耳蝸是治療的前提，為此我們建立了干細(xì)胞向動(dòng)物耳蝸移植的方法。
　　方法:雛雞耳蝸的干細(xì)胞移植是經(jīng)外耳道剝離鼓膜，暴露中耳腔的蝸窗，再經(jīng)蝸窗膜造孔注入干細(xì)胞。成年豚鼠耳蝸鼓階的干細(xì)胞移植是行耳后切口暴露聽泡，在耳蝸底轉(zhuǎn)近鐙骨動(dòng)脈處鉆孔，并注入GFP標(biāo)記的干細(xì)胞。中階的移植是經(jīng)耳蝸第三轉(zhuǎn)的血管紋外側(cè)壁注入干細(xì)胞。細(xì)胞移植1天后，分離雛雞和豚鼠的耳蝸?zhàn)鞅鶅銮衅?，在熒光顯微鏡下觀察移植細(xì)胞的分布