永生化肝前體細(xì)胞株的構(gòu)建及維甲酸在肝前體細(xì)胞分化中的作用研究.pdf

1、肝臟疾病最終常常發(fā)生功能的紊亂和臟器的衰竭。肝移植為肝臟疾病的治療提供了無(wú)限前景。但供體肝源不足、排斥反應(yīng)及長(zhǎng)期免疫抑制劑的治療限制了肝移植的發(fā)展。肝干細(xì)胞移植成為一種有潛力的替代治療方法。同時(shí)對(duì)肝干細(xì)胞增殖、分化的研究還有助于了解肝臟的發(fā)生、發(fā)育機(jī)制，為進(jìn)一步研究肝癌的發(fā)病機(jī)制及治療提供基礎(chǔ)。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及免疫學(xué)的發(fā)展，肝干細(xì)胞的分離鑒定和培養(yǎng)取得了一些進(jìn)展。但如何分離、篩選獲得高純度、高特異性的肝

2、干細(xì)胞，如何建立肝干細(xì)胞穩(wěn)定的體外培養(yǎng)系統(tǒng)，如何調(diào)節(jié)肝干細(xì)胞特異分化，仍是急需解決的問(wèn)題。 在該課題的第一部分中，我們首先制備了含LoxP位點(diǎn)特異修飾的SV40大T抗原基因的SSR＃69逆轉(zhuǎn)錄病毒液，并感染從孕14.5d的胎鼠肝臟中分離出的肝細(xì)胞（此時(shí)的肝細(xì)胞被認(rèn)為大部分為肝前體細(xì)胞），使其永生化。再用有限稀釋法培養(yǎng)獲得單克隆永生化細(xì)胞株，并進(jìn)一步篩選鑒定。首先取不同階段的肝組織：孕12.5d、14.5d、16.5d、18.5d

3、及出生后1d、7d、14d、28d，利用real time PCR觀察常見(jiàn)的早期指標(biāo)和晚期指標(biāo)的表達(dá)趨勢(shì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其早期標(biāo)志基因CD34、Pou5f1隨組織的發(fā)育成熟逐漸降低；AFP早期逐漸上升，至出生前達(dá)到最高，出生后開(kāi)始迅速降低；DLK早期逐漸上升，至16.5d達(dá)到最高，后逐漸降低。晚期標(biāo)志基因A1b、CK18、TAT、ApoB隨組織的發(fā)育成熟逐漸上升，TAT上升較晚，約出生后第二周開(kāi)始。在此基礎(chǔ)上我們以相同方法獲得的出生后14d的

4、永生化肝細(xì)胞株LC14d及肝腫瘤細(xì)胞株Hepal-6為對(duì)照，篩選出高表達(dá)早期標(biāo)志基因的單克隆細(xì)胞株5個(gè)，并進(jìn)一步通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、地塞米松和二甲亞楓誘導(dǎo)分化等進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示篩選獲得的單克隆細(xì)胞株細(xì)胞增殖旺盛、成集落樣生長(zhǎng)，體積較小、多邊形、核漿比例高。經(jīng)誘導(dǎo)分化后，ICG攝取試驗(yàn)證實(shí)篩選出的單克隆細(xì)胞株可誘導(dǎo)分化為成熟的肝細(xì)胞，為具有分化潛能的肝前體細(xì)胞。連續(xù)傳代50代后檢測(cè)細(xì)胞無(wú)明顯差異。第二步我們檢測(cè)導(dǎo)入的外源基因SV40大T抗原

5、是否可逆。首先我們用western blot檢測(cè)證實(shí)獲得的永生化肝前體細(xì)胞株有大T抗原的表達(dá)，說(shuō)明SV40大T抗原的導(dǎo)入成功。而加入腺病毒Ad-Cre處理后，細(xì)胞無(wú)大T抗原的表達(dá)，說(shuō)明在Cre重組酶的作用下，大T抗原可以被敲除。而經(jīng)腺病毒Ad-Cre處理的單克隆細(xì)胞株生長(zhǎng)曲線降低，白蛋白熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)顯示白蛋白表達(dá)上升，即分化增加。也證實(shí)SV40大T抗原可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的分化，而Cre重組酶可敲除LoxP位點(diǎn)特異修飾的S

6、V40大T抗原基因。第三步體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)。我們于皮下注入熒光素酶標(biāo)記的永生化肝前體細(xì)胞株，對(duì)側(cè)注入同樣標(biāo)記的經(jīng)Cre重組酶處理的永生化肝前體細(xì)胞株，并以肝癌細(xì)胞株為對(duì)照，活組織成像隨訪。結(jié)果顯示隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，植入細(xì)胞熒光素酶的表達(dá)降低，說(shuō)明皮下存活的細(xì)胞數(shù)減少。與肝癌細(xì)胞株相比，皮下植入永生化肝前體細(xì)胞株熒光素酶的表達(dá)在10天內(nèi)基本消失，沒(méi)有成瘤的趨勢(shì)。而經(jīng)Cre重組酶處理后的永生化肝前體細(xì)胞株，熒光素酶的表達(dá)消失提前，說(shuō)明細(xì)胞增殖降低

7、，存活時(shí)間縮短。這同樣也說(shuō)明導(dǎo)入的大T抗原可以被敲除，是可逆的。因此，在第一部分實(shí)驗(yàn)中，我們獲得了可逆的永生化的肝前體細(xì)胞株，為我們第二部分的實(shí)驗(yàn)打下良好的基礎(chǔ)。 在該課題的第二部分中，我們檢測(cè)了維甲酸（Retinoic acid，RA）對(duì)肝前體細(xì)胞分化的影響。維甲酸是維生素A的體內(nèi)衍生物。和其它類(lèi)視黃醇一樣，它在脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定及細(xì)胞的增殖分化中都發(fā)揮著重要作用。但維甲酸在組織特異性前體細(xì)胞分化中的作用報(bào)道卻很

8、少。因此，本課題在第一部分構(gòu)建永生化肝前體細(xì)胞株的前提下，進(jìn)一步研究了維甲酸對(duì)胎肝前體細(xì)胞分化的影響，以期獲得一種誘導(dǎo)肝前體細(xì)胞分化的新方法，并進(jìn)一步研究維甲酸誘導(dǎo)肝前體細(xì)胞分化的機(jī)制。而維甲酸可誘導(dǎo)與肝臟具有共同起源的胰腺祖細(xì)胞的增殖和進(jìn)一步分化為β細(xì)胞，也提示維甲酸可能在肝臟的發(fā)育中有重要作用。 在該部分研究中我們首先檢測(cè)了不同階段的肝組織中內(nèi)源性維甲酸合成代謝相關(guān)基因及維甲酸受體和輔助因子的表達(dá)水平。結(jié)果顯示維甲酸受體RA

9、Rα、RXRα和RXRγ在所有樣品中均有表達(dá)；而RARβ和RXRβ在出生前表達(dá)較低而出生后逐漸升高；RARγ在出生前無(wú)表達(dá)，出生后逐漸上升。維甲酸合成酶Raldh1和Raldh2在所有組織中均有表達(dá)，Raldh3在出生前表達(dá)很低，出生后穩(wěn)定表達(dá)。核受體共抑制劑在所有樣品中均高表達(dá)，而共激動(dòng)劑在出生前逐漸降低，出生后逐漸上升。提示維甲酸信號(hào)系統(tǒng)可能和肝前體細(xì)胞的分化密切相關(guān)。我們進(jìn)一步利用白蛋白熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒篩選獲得了全反式維甲酸和9-

10、順式維甲酸最適藥物濃度，通過(guò)最適藥物濃度的全反式維甲酸和9-順式維甲酸誘導(dǎo)，RT-PCR檢測(cè)可見(jiàn)其早期標(biāo)志基因表達(dá)降低，晚期標(biāo)志基因表達(dá)上升，免疫熒光檢測(cè)得出一致的結(jié)論。糖原沉積試驗(yàn)結(jié)果顯示誘導(dǎo)后糖原沉積增加。以上結(jié)果說(shuō)明全反式維甲酸和9-順式維甲酸能促進(jìn)肝前體細(xì)胞向前肝細(xì)胞的分化。為進(jìn)一步了解參與該途徑的維甲酸受體，我們構(gòu)建了腺病毒RARa和RXRα，感染細(xì)胞后通過(guò)白蛋白熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒檢測(cè)其分化的改變。結(jié)果顯示感染腺病毒RARα或R