小分子化合物誘導大鼠肝干樣細胞向胰腺內分泌前體細胞分化的研究.pdf

1、目的：用小分子化合物在體外誘導肝干樣細胞分化為胰腺內分泌前體細胞，建立一種以肝干樣細胞來源的胰腺內分泌前體細胞的非轉基因的實驗方法，為進一步建立肝干細胞高效、特異的向胰腺β細胞轉分化的技術體系的研究奠定基礎。
　　方法：選用5-氮雜胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine，5-AZA），曲古霉素A(TrichostatinA，TSA)，維甲酸(Retinoic acid，RA)，胰島素轉鐵蛋白硒(Insulin，tran

2、sferrin andselenite，ITS)等小分子化合物，分兩步法直接誘導肝干樣WB-F344細胞（WB細胞）分化為表達胰腺十二指腸同源框蛋白1(Pancreatic and duodenal homeoboxfactor1，PDX1)的胰腺內分泌前體細胞，用含有1uM-10uM10個不同濃度5-AZA分化培養(yǎng)基誘導WB分化，摸索誘導分化的最佳條件。倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化，用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、免疫熒光和

3、葡萄糖刺激試驗對第一步誘導細胞（WB-1細胞）和胰腺內分泌前體細胞（WB-A細胞）進行鑒定。
　　結果：⑴顯微鏡觀察:5-AZA5 uM處理2d，TSA1 d，約20％ WB細胞由橢圓形或多邊形向梭狀細胞改變，此時細胞為WB-1細胞;WB-1經(jīng)RA聯(lián)合ITS誘導7d，細胞形態(tài)類似于WB-1細胞，但核漿比例增大，此時細胞為WB-A細胞。⑵WB-1細胞RT-PCR結果:WB細胞不表達胰腺相關基因，表達ALB，AFP，GLUT2等基因。

4、WB-1細胞中未表達PDX1及其它胰腺發(fā)育相關基因，肝細胞表達基因ALB，AFP和標志肝細胞去分化的基因C/EBPβ開始下調。⑶WB-A細胞定量PCR和半定量PCR結果:5-AZA濃度為5 uM時，獲得的WB-A細胞PDX1表達量最高，標志肝干細胞分化的基因C/EBPβ下調;WB-A表達NGN3，Neurod，NKX2.2等胰腺內分泌前體細胞相關基因;Nestin持續(xù)表達，Insulin1表達上調。⑷WB-A細胞免疫熒光:WB-A細胞P