動力性三維細胞培養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠胰腺導(dǎo)管來源干細胞向胰島素分泌細胞分化的研究.pdf

1、胰島細胞移植是治療糖尿病的最佳有效方法之一，然而胰島細胞移植對供胰的需求量大（需要2-4個成人胰腺），胰島來源不足是目前限制其臨床應(yīng)用的重要原因。因此探索新的胰島細胞途徑成為研究的熱門研究之一。近年來，隨著組織工程及細胞工程的日益起色，干細胞研究為擴大胰島來源開辟了新的路線。
　　機體在生理狀態(tài)下，或者受到損傷時，體內(nèi)許多細胞死亡，但有些器官能夠更新這些細胞，從而可以使機體的正常機能得以維持，這種再生潛能便是依賴于成體干細胞(ad

2、ult stem cell，ASC)。胰腺在肥胖或妊娠的情況下也能夠發(fā)生生理性增生，提示在胰腺內(nèi)也存在可以增殖分化的成體干細胞[1]。與其它成體干細胞相比，胰腺干細胞的研究較為滯后。目前還沒有建立獲得廣泛認同的胰腺干細胞系[2]。根據(jù)發(fā)生學(xué)起源，胰腺內(nèi)的成體干細胞屬于起源于中胚層的間充質(zhì)干細胞，它的特點是具有多向分化潛能并且能夠自我更新，可分化為胰腺組織的各種細胞。目前認為，間充質(zhì)干細胞可能是可誘導(dǎo)分化為胰島樣細胞團的祖細胞（或稱前體細

3、胞），有望成為解決胰島來源的途徑[3]。
　　目前，胰腺間充質(zhì)干細胞存在的部位還沒有完全確定。胰島內(nèi)部、胰腺外分泌腺內(nèi)、胰腺導(dǎo)管內(nèi)均可能存在分化程度不同的干細胞或祖細胞[4]。目前研究認為朗罕氏胰島可由胰腺導(dǎo)管上皮細胞及位于胰島內(nèi)部的胰島源性前體細胞(islet-derived precursor cells，IPCs)分化新生而成。多個實驗室報道離體分離培養(yǎng)的胰腺導(dǎo)管上皮細胞，經(jīng)條件培養(yǎng)后能獲得成纖維樣細胞，表達CD13、CD2

4、9、CD44、CD49b、CD54等抗原，與間充質(zhì)干細胞相一致[5、6]。將這些培養(yǎng)后的胰島樣細胞移植入糖尿病小鼠體內(nèi)，可釋放胰島素，降低血糖，延長受體存活時間。這些研究為建立工程性β細胞系以獲得無限的胰島細胞來源帶來了新的曙光。
　　以目前的技術(shù)，在分離純化胰島過程中，只有不到10％的胰島組織得以應(yīng)用，其余均被廢棄。胰導(dǎo)管正是存在于被“廢棄”的組織中。如果能夠分離并誘導(dǎo)其增殖分化為有功能的胰島樣細胞團，將為擴大胰島來源提供新的途

5、徑。
　　胰腺導(dǎo)管來源干細胞作為成體干細胞，操作方法要比胚胎干細胞容易，而且具有較高的成功率，此外，成體干細胞導(dǎo)致腫瘤形成的風(fēng)險也要低很多，更加可以規(guī)避倫理學(xué)問題[7、8])。在人與哺乳動物特定組織與器官中，有許多成體干細胞存在，這些細胞是自我更新能力很強，并且具有一定分化潛能的前體細胞，這些細胞成熟并可以分化，成為所屬組織的細胞類型。新近的研究表明，成體干細胞屬多能干細胞，具有“可塑性”，即可分化生成另一組織的特定細胞，保持向多

6、種組織分化的能力[10]。因此，綜上所述，如果能夠?qū)⒁认匍g充質(zhì)干細胞在體外通過一定的方法使其增殖并定向分化為胰島細胞，則有望應(yīng)用于臨床，治療糖尿病。
　　目前，盡管細胞培養(yǎng)技術(shù)成熟且方法多樣，經(jīng)胰腺間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化所獲得的胰島樣細胞，在外形上與朗罕氏胰島結(jié)構(gòu)相近，但功能上難以達到臨床細胞替代治療的目的。具體表現(xiàn)在[9]：①體外誘導(dǎo)獲得的胰島樣結(jié)構(gòu)中，內(nèi)分泌細胞的所占比例較小，而且細胞連接缺乏;②合成和釋放胰島素的量比正常值低;

7、③在應(yīng)對葡萄糖的刺激時，缺乏胰島素的急性分泌反應(yīng);④胞漿中分泌胰島素顆粒缺乏;⑤胰島樣結(jié)構(gòu)分化不徹底，其內(nèi)尚含有未分化細胞，以及部分分化的細胞。因此目前所應(yīng)用的培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化方案存在著不完善，如何最大程度的模擬體內(nèi)微環(huán)境是一個明確的研究方向。
　　最近學(xué)界新興了一種細胞培養(yǎng)方法，即為三維細胞培養(yǎng)(three-dimension cell culture，TDCC)，其特點是應(yīng)用三維結(jié)構(gòu)載體，與細胞在體外共同培養(yǎng)，這樣細胞便能在載體

8、的三維空間中定植生長，最后形成細胞載體復(fù)合物，細胞生長環(huán)境達到體內(nèi)環(huán)境最大程度的模擬。
　　目前三維細胞培養(yǎng)可分為兩類，靜止性及動力性三維培養(yǎng)，動力性三維培養(yǎng)在更加具有優(yōu)勢，具體表現(xiàn)為[10]：①黏附生長細胞的增殖加快，細胞外基質(zhì)提供的更豐富，組織再生能力更好;;②細胞植入數(shù)量能夠達到最大化;③氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)向載體內(nèi)部輸送更加充分，細胞活性更加易于保持;④細胞能夠沿著孔隙生長，成為三維立體組織;⑤培養(yǎng)液流動過程中，細胞受到機械應(yīng)力

9、的刺激，細胞功能得以最大程度發(fā)揮;⑥CO2可以被更快的排出，生理性pH值得以維持，細胞代謝和功能能夠在最有利的微環(huán)境中進行。因此，動力性三維細胞培養(yǎng)不僅在生物性微環(huán)境和力學(xué)刺激方面提供優(yōu)勢，而且細胞功能能夠得到最大程度發(fā)揮。動力性三維細胞培養(yǎng)相關(guān)之聚合三維支架材料及生物灌注反應(yīng)系統(tǒng)已商品化，可方便購得。
　　目的：
　　本研究擬利用胰島分離后的大鼠胰腺組織（含有外分泌細胞和導(dǎo)管細胞）分離胰腺導(dǎo)管上皮細胞，完善胰腺導(dǎo)管細胞分離

10、方法，利用動力性三維細胞培養(yǎng)技術(shù)使其增殖并分離，通過鑒定確認為胰腺間充質(zhì)干細胞，通過持續(xù)擴增培養(yǎng)建立起大鼠的胰腺干細胞系，并誘導(dǎo)其向可釋放胰島素的胰島樣細胞團定向分化，探索完善誘導(dǎo)分化所需條件及更合適的體外微環(huán)境，確定誘導(dǎo)細胞團的形態(tài)、表達特性和功能。本研究以大鼠胰腺作為研究對象，建立大鼠的胰腺間充質(zhì)干細胞系，采用新興的動力性三維細胞培養(yǎng)技術(shù)，模擬體內(nèi)微環(huán)境，為改進干細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)方法提供新的思路。為解決胰島來源提供新的途徑。
　　

11、方法：
　　原料采用大鼠的胰腺組織，應(yīng)用0.1％V型膠原酶對大鼠胰腺組織進行原位消化分離，通過不連續(xù)密度梯度離心的方法，使得胰島細胞和胰腺導(dǎo)管細胞初步分離，將胰島細胞廢棄，留取胰腺導(dǎo)管細胞進行培養(yǎng)，在動力性三維細胞培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)果為獲得原代PDSC，并采用含血清培養(yǎng)基進行擴增培養(yǎng)，連續(xù)傳代，純化PDSC，完善原代胰腺導(dǎo)管來源干細胞的分離方法、探討培養(yǎng)條件以及影響因素。鑒定原代分離的PDSC，包括形態(tài)學(xué)鑒定、表達特性鑒定

12、，以及分化能力鑒定。連續(xù)傳代，建立胰腺導(dǎo)管來源干細胞系。并對PDSC進行體外誘導(dǎo)分化，使其定向分化為有功能的胰島樣細胞團，并對細胞團進行形態(tài)學(xué)鑒定以及表達特性等方面的鑒定。
　　結(jié)果：
　　通過原位0.1％V型膠原酶消化，之后進行不連續(xù)密度梯度離心，再繼以動力性三維培養(yǎng)，可分離培養(yǎng)出大鼠PDSC。形態(tài)學(xué)方面，PDSC呈單個核。生長行為方面，PDSC在三維載體上沿纖維貼壁生長。通過流式細胞儀分選進行表達特性分析可以得出，CD1

13、05、CD73、CD29、CD90在PDSC呈高表達，而CD45、CD14、CD19、CD34呈不表達，由此可以證明PDSC為間充質(zhì)干細胞。
　　在動力性三維細胞培養(yǎng)14天左右，PDSC可以定向分化為胰島樣細胞團(islet-like cell cluster，ICC)。在形態(tài)學(xué)方面可以觀察到ICC表現(xiàn)為細胞融合，成團狀聚集，分化后期自培養(yǎng)基脫壁，呈懸浮生長;表達特性方面鑒定采用免疫細胞化學(xué)染色，結(jié)果提示ICC胰島素的染色呈現(xiàn)為陽

14、性，提示ICC在蛋白分子水平表達胰島素;雙硫腙(DTZ)染色結(jié)果顯示，ICC在誘導(dǎo)培養(yǎng)2周時可以被染成紅色，由此證明細胞團內(nèi)含有胰島素的蛋白分解產(chǎn)物。胰島素定量測定結(jié)果顯示，ICC在誘導(dǎo)培養(yǎng)14天時，其細胞外液與細胞的胞漿內(nèi)均含可以檢測得到胰島素水平，與誘導(dǎo)培養(yǎng)前的PDSC的細胞胞漿內(nèi)的胰島素水平做比較，有顯著性差異(P＜0.01);但葡萄糖刺激下胰島素釋放試驗結(jié)果顯示，ICC的釋放指數(shù)SI為1.40，說明ICC的胰島素釋放為非細胞外液

15、葡萄糖濃度依賴性，即ICC仍是未成熟的胰島素分泌細胞。
　　結(jié)論：
　　1.完善胰腺導(dǎo)管細胞分離方法：采用原位膠原酶消化法，通過不連續(xù)密度梯度離心分離，再繼以動力性三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)進行細胞培養(yǎng)，可以得到大鼠PDSC，并成功建立PDSC細胞系。
　　2.大鼠PDSC是一種表達PDX-1和nestin的MSC。
　　3.通過體外動力性三維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，可誘導(dǎo)胰腺PDSC定向分化為有功能的胰島樣細胞團。
　　4.