大鼠骨髓間質(zhì)干細胞體外誘導橫向分化為胰島素分泌細胞的實驗研究.pdf

1、[目的] 探索體外定向誘導成年大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞橫向分化為胰島素分泌細胞的可能性，并檢測誘導后的細胞是否具備分泌胰島素和胰高血糖素的功能。 [方法] 利用長骨打斷法從健康成年大鼠長骨中沖洗出骨髓細胞，用含20﹪胎牛血清(FBS)的LG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)原代細胞以利于細胞生長，通過換液將懸浮生長的造血干細胞及其它不貼壁的雜細胞去除，原代細胞長滿匯合80﹪所需時間為7-9天，然后細胞通過傳代進行純化和擴增。采用兩期誘導方案對第三

2、代(P3)或以后細胞進行誘導，第一期：用誘導液1(含20 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子，10ng/mL表皮細胞生長因子及2﹪B27的DMDM/F12培養(yǎng)液)誘導BMSCs向巢蛋白(nestin)陽性的祖細胞分化；第二期：用誘導液2(含10 ng/mL β細胞調(diào)節(jié)素，10 ng/mL肝細胞牛長因子，10 ng/mL活化素A和10 mmoL/L尼克酰胺及2﹪B27的HG-DMEM培養(yǎng)液)將nestin陽性的祖細胞向胰島素分泌細胞誘導分化

3、。用雙硫腙(DTZ)染色鑒定誘導后的細胞團是否含有胰島素；免疫熒光法、免疫組織化學法(卵白鏈霉素-過氧化氫-DAB)檢測誘導前后nestin，、胰島素、胰高血糖素蛋白的表達；用含5.6 mmol/L葡萄糖(L)、16.7mmol/L葡萄糖(H)的PBS緩沖液l mL先后不同次序分別孵育1/2 h、1h，收集上清，采用放射免疫分析法檢測各上清中的胰島素含量。 [結(jié)果]通過傳代純化后的BMSCs(P6)經(jīng)流式細胞儀檢測表面標志CD4

4、5(-)、CD29(+)及CD90(+)，并且檢測傳代后的細胞純度可達99.88﹪。 BMSCs經(jīng)第一期誘導3d即可檢測出nestin蛋白的表達，兩期誘導后的細胞團用雙硫腙染色呈陽性。免疫細胞化學顯示經(jīng)兩期誘導后的細胞團表達胰島素、胰高血糖素等激素。放免分析結(jié)果顯示二期誘導后的細胞團可以分泌少量的胰島素，糖反應性較弱。 [結(jié)論]健康成年大鼠骨髓間質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)具有很強的增殖能力，并且具有一定的可塑性。傳代純化后的BMSCs通過