糖尿病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的研究.pdf

1、研究背景： 胰島β細(xì)胞功能的進(jìn)行性衰竭是糖尿病(diabetes mellitus，DM)發(fā)身發(fā)展的根本原因，1型和2型DM都存在著這種不同程度的病理生理狀態(tài)。目前臨床治療有多種途徑，例如注射外源性胰島素、口服降糖藥物等，但這些治療都只能減輕或延緩DM及其并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展，尚不能完全根治DM。以胰腺移植和胰島細(xì)胞移植為主的再生治療為DM的根治帶了新的希望和思路，但胰腺移植和胰島細(xì)胞移植仍然面臨供體缺乏及免疫排斥反應(yīng)這兩大難題，

2、使其效果和臨床應(yīng)用受到了極大的影響。隨著近幾年干細(xì)胞研究的進(jìn)展以及認(rèn)識(shí)的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到可以利用干細(xì)胞替代、修復(fù)或加強(qiáng)受損組織或器官的功能。 間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓中的一種分泌多種細(xì)胞因子的較原始的骨髓基質(zhì)細(xì)胞，具有基質(zhì)細(xì)胞的特性，可以分化為造血實(shí)質(zhì)，支持造血；同時(shí)具有多向分化潛能和自我更新能力，在適宜的培養(yǎng)條件下可增殖并被誘導(dǎo)分化成多種造血以外的組織細(xì)胞。自從

3、1968年Friedenstein等人首先證實(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓組織中大量存在以來，它的多分化潛能受到越來越多的廣泛關(guān)注。國內(nèi)外眾多研究證實(shí)，在特定的誘導(dǎo)條件下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marroW-derived mesenchymalstem cells，BM-MSCs)可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌腱、肌肉和韌帶等多種中胚層來源的細(xì)胞，不僅如此，還可以跨胚層分化為肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等內(nèi)胚層和外胚層來源的各種細(xì)胞。所以近年

4、來，BM-MSCs的功能作用和臨床應(yīng)用成為醫(yī)學(xué)界普遍關(guān)注的研究熱點(diǎn)，其已經(jīng)成為一種理想的組織工程的種子細(xì)胞。BM-MSCs不僅具有取材方便、擴(kuò)增迅速的特點(diǎn)，更重要的一點(diǎn)在于患者可以利用自身骨髓來源的干細(xì)胞治療疾病，實(shí)現(xiàn)真正的自體移植，從而克服移植排斥反應(yīng)。因此，MSCs作為一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，已經(jīng)成為人們尋找胰島β細(xì)胞替代物的新資源。在此基礎(chǔ)之上，本研究選取DM患者的骨髓，建立適宜的BM-MSCs體外培養(yǎng)體系，并通過形

5、態(tài)學(xué)特征、表面標(biāo)志以及多向分化功能等方面進(jìn)行鑒定，同時(shí)探討在體外條件下自體BM-MSCs誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞(insulin-producing cells，IPCs)的可行性，證實(shí)病理狀態(tài)下BM-MSCs的分化能力，從而為DM患者實(shí)現(xiàn)自體骨髓干細(xì)胞移植治療糖尿病奠定理論基礎(chǔ)。 第一部 分糖尿病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定研究 目的:本研究旨在 1)建立DM患者BM-MSCs的體外培養(yǎng)體系；

6、 2)檢測(cè)BM-MSCs的基本生物學(xué)特性； 3)對(duì)BM-MSCs具有向骨、軟骨、脂肪及神經(jīng)等多方向的分化能力進(jìn)行鑒定；從而為以MSCs為基礎(chǔ)的組織細(xì)胞工程提供實(shí)驗(yàn)理論基礎(chǔ)。 研究方法: 隨機(jī)選取10名行自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療DM的患者作為研究對(duì)象。無菌條件下，自髂后上嵴行多點(diǎn)穿刺取肝素化骨髓標(biāo)本5ml，利用Ficoll-Hypaque分離液(相對(duì)密度1.077±O.001g/ml)密度梯度離心分離得到

7、骨髓單個(gè)核細(xì)胞后，體外以DMEM-LG培養(yǎng)基(含有10﹪FCS)培養(yǎng)，常規(guī)胰蛋白酶-EDTA混合消化液進(jìn)行傳代擴(kuò)增，通過H.E染色，Giemsa染色觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BM-MSCs表面標(biāo)志，并最后進(jìn)行向成骨，軟骨，脂肪，神經(jīng)細(xì)胞方向的誘導(dǎo)分化，以期通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)，表面標(biāo)志，多向分化功能對(duì)BM-MSCs進(jìn)行綜合鑒定。 研究結(jié)果: 1)DM患者的BM-MSCs為成纖維樣細(xì)胞的細(xì)胞群體，以均一的、梭形的成纖維樣細(xì)胞為

8、主。H.E和Giemsa染色后，于光鏡下可見細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)梭形或多角形，核大，核漿比例高，居中，可見有3個(gè)核的細(xì)胞； 2)原代培養(yǎng)周期大約為18～20天，胰蛋白酶．EDTA常規(guī)消化，經(jīng)過3～5代后BM-MSCs基本達(dá)到形態(tài)均一。P10，P20的細(xì)胞仍可呈高度均質(zhì)的梭形細(xì)胞群，平行或旋渦狀方式生長(zhǎng)。體外可以連續(xù)傳至P20仍能保持原始未分化狀態(tài)。 3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)BM．MSCs表面抗原分子，結(jié)果顯示BM-MSCs均一的表達(dá)C

9、D29、CD44、CD106陽性，不表達(dá)CD14、CD34、CD45等造血細(xì)胞特異性表面分子； 4)DM患者的BM-MSCs在體外適宜的條件下，成功向骨，軟骨，脂肪，神經(jīng)細(xì)胞方向進(jìn)行分化，細(xì)胞組織化學(xué)染色，RT-PCR，免疫組化均支持上述結(jié)果： 結(jié)論: 1)成功地進(jìn)行了DM患者BM-MSCs的分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增。利用Ficoll-Hypaque分離液(相對(duì)密度1.077±0.001g/ml)密度梯度離心分離骨髓細(xì)胞

10、，取骨髓MNCs以DMEM-LG培養(yǎng)基培養(yǎng)，可以獲得純度較高的BM-MSCs。并建立了適合其增殖的體外培養(yǎng)體系，證實(shí)BM-MSCs具有強(qiáng)大的體外增殖儲(chǔ)備和擴(kuò)增能力，并且可以在體外擴(kuò)增達(dá)P20仍能夠保持未分化狀態(tài)，其可以用于進(jìn)一步的組織工程、細(xì)胞和分子生物學(xué)研究； 2)分離擴(kuò)增的DM患者BM．MSCs不表達(dá)CD34、CD45、CD14這些造血干細(xì)胞的分子標(biāo)記，高度表達(dá)CD29、CD44、CD106多種膜表面蛋白，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；

11、 3)DM患者BM-MSCs在體外具有多分化潛能，可以向中胚層3種細(xì)胞(骨、軟骨和脂肪細(xì)胞)及中胚層(神經(jīng)細(xì)胞)分化； 4)結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)、表面標(biāo)記以及分化功能等多方面鑒定，表明所分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增的細(xì)胞群中確實(shí)存在具有多潛能ASCs特性的無造血細(xì)胞系污染的BM-MSCs； 第二部分 糖尿病患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞研究 目的:探索誘導(dǎo)糖尿病患者BM-MSCs向IPCs分化的條件，證實(shí)在

12、病理狀態(tài)下糖尿病患者自體BM-MSCs仍然具備分化為IPCs的潛能，為獲得大量胰島β細(xì)胞用于細(xì)胞替代療法治療DM尋找新的出路。 研究方法: 選取10名糖尿病患者的BM-MSCs，分離提純后，選用三步誘導(dǎo)方案進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化為：IPCs的實(shí)驗(yàn)。RT-PCR檢測(cè)一系列與β細(xì)胞發(fā)育和功能相關(guān)的基因表達(dá)：免疫組化，雙硫腙染色證實(shí)IPCs的生成；酶聯(lián)免疫法檢測(cè)胰島素的分泌量。 研究結(jié)果: 1)誘導(dǎo)分化18天后，鏡下

13、成功觀察到胰島樣細(xì)胞團(tuán)的生成，雙硫腙及免疫組化染色胰島素均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)； 2)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞在第二階段(第10天)能夠表達(dá)nestin，PDX-1，Ngn3，Pax4，insulin，glucagon，而第三階段(第18天)則可以觀察到PDX-1，insulin，glucagon的高表達(dá)； 3)這些誘導(dǎo)分化的細(xì)胞接受葡萄糖刺激后能夠分泌胰島素，且胰島素的分泌量隨葡萄糖濃度的提高而增加(P<0.05)； 結(jié)論: