電刺激促進(jìn)大鼠視網(wǎng)膜前體細(xì)胞增殖分化的初步實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性、視網(wǎng)膜脫離等疾病可以造成視網(wǎng)膜神經(jīng)元不同程度的凋亡，最終導(dǎo)致不可逆性視力損害。目前臨床上尚無(wú)根治這類(lèi)疾病的有效方法，神經(jīng)保護(hù)藥物或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子補(bǔ)充等方法只是著眼于保護(hù)未凋亡的神經(jīng)元，對(duì)于已經(jīng)受損的視網(wǎng)膜神經(jīng)元卻無(wú)能為力;干細(xì)胞的應(yīng)用則是立足于施救已受損的神經(jīng)元，可在一定程度上逆轉(zhuǎn)疾病的進(jìn)程，但干細(xì)胞移植治療仍需面臨移植細(xì)胞的免疫排斥、供體來(lái)源以及與宿主視網(wǎng)膜的有效整合等諸多問(wèn)題。因此，如何原

2、位誘導(dǎo)自體內(nèi)源性視網(wǎng)膜前體細(xì)胞增殖、分化備受研究者的關(guān)注。目前的研究證明，睫狀體邊緣帶細(xì)胞、虹膜色素上皮細(xì)胞、Müller細(xì)胞都可能作為成年哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜干細(xì)胞來(lái)源，其中以睫狀體邊緣帶細(xì)胞、Müller細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜干細(xì)胞最為重要，常常被稱(chēng)為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞。
　　電刺激(electrical stimulation，ES)在一些動(dòng)物模型和臨床研究中都初步顯示了良好的促細(xì)胞增殖分化效果，且副作用小，引起了眼科學(xué)者們的關(guān)注。本研究

3、旨在探討電刺激對(duì)睫狀體邊緣帶細(xì)胞、Müller細(xì)胞來(lái)源的視網(wǎng)膜前體細(xì)胞增殖分化的影響，并對(duì)電刺激后即早基因Gadd45β在視網(wǎng)膜前體細(xì)胞增殖分化過(guò)程中的表達(dá)調(diào)控作用進(jìn)行研究和探索。
　　第一部分跨角膜電刺激促進(jìn)成年大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細(xì)胞增殖分化
　　目的: 旨在探討跨角膜電刺激促進(jìn)成年大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細(xì)胞增殖分化。
　　方法: 成年雌性SD大鼠予以每日腹腔注射BrdU（100mg/kg），連續(xù)腹腔注射

4、5天用于標(biāo)記增殖細(xì)胞。大鼠左眼接受電刺激（電刺激參數(shù):雙相方波電流:波寬3ms，頻率20Hz，強(qiáng)度300uA，刺激時(shí)間持續(xù)1h），右眼為自身對(duì)照，并設(shè)假手術(shù)組，每組每時(shí)點(diǎn)為4只SD大鼠。電刺激后不同時(shí)間點(diǎn)(1d、4d、7d、10d、14d)心臟灌注處死SD大鼠后摘除眼球制作視網(wǎng)膜冰凍切片，免疫熒光觀察睫狀體邊緣帶BrdU陽(yáng)性細(xì)胞以明確增殖細(xì)胞的數(shù)量及部位并計(jì)數(shù)，免疫化學(xué)染色共聚焦顯微鏡觀察睫狀體邊緣帶BrdU陽(yáng)性細(xì)胞Nestin的表達(dá)情

5、況，以明確增殖細(xì)胞是否為視網(wǎng)膜前體細(xì)胞。為了評(píng)估電刺激條件的安全性，選取電極作用部位的角膜組織，電鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。同時(shí)，在大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)檢測(cè)到即早基因Gadd45β的表達(dá)并進(jìn)一步Western Blot免疫印跡法檢測(cè)電刺激后大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Gadd45β的表達(dá)水平。
　　結(jié)果: 電刺激前后大鼠角膜組織形態(tài)未發(fā)生明顯改變，提示該電刺激條件具有一定的安全性。視網(wǎng)膜冰凍切片免疫熒光觀察顯示:電刺激后第4天SD大鼠睫狀體邊緣帶細(xì)胞開(kāi)始出

6、現(xiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞，且電刺激后7d、10d和14d睫狀體邊緣帶BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，BrdU陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。電刺激后第4天SD大鼠睫狀體邊緣帶BrdU細(xì)胞Nestin染色陽(yáng)性，且隨時(shí)間的延長(zhǎng)Nestin染色陽(yáng)性逐漸增強(qiáng)，提示電刺激后大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細(xì)胞存在增殖現(xiàn)象。電刺激后大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)Gadd45β的表達(dá)一過(guò)性增加。
　　結(jié)論: 經(jīng)角膜低電流刺激后成年大鼠睫狀體邊緣帶視網(wǎng)膜前體細(xì)胞出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，并伴有視

7、網(wǎng)膜內(nèi)即早基因Gadd45β一過(guò)性表達(dá)增加。
　　第二部分電刺激促進(jìn)大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子作用的評(píng)估
　　目的: 旨在探討電刺激影響大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
　　方法: 選取新生2天SD大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞體外培養(yǎng)，電鏡下觀察體外培養(yǎng)的Müller細(xì)胞的形態(tài);谷氨酰胺合成酶(GS)免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定體外培養(yǎng)的Müller細(xì)胞表型。參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)給予Muller細(xì)胞一定

8、模式的電刺激(電刺激參數(shù):雙相方波電流，電刺激參數(shù):波寬3ms，頻率20Hz，強(qiáng)度300uA，單次刺激時(shí)間1h)，電刺激后不同時(shí)間點(diǎn)(0h、1h、2h、3h、6h、12h)行Realtime-PCR、Western Blot檢測(cè)BDNF、bFGF神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌情況及Gadd45家族各因子的表達(dá)情況。
　　結(jié)果: 電鏡下觀察體外培養(yǎng)的SD大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)形似纖維，免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示Müller細(xì)胞特異性谷氨酰胺