全反式視黃酸誘導(dǎo)新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞向光感受器細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：探討全反式視黃酸（all-trans retinoic acid，ATRA）誘導(dǎo)新生大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞（neural retinal progenitor cell，NRPC）向光感受器細(xì)胞分化的作用。 方法：從新生Sprague-Dawley大鼠（出生后第一天，day1 postnatal，P1）視網(wǎng)膜分離并擴(kuò)增視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞（retinal progenitor cells，RPC），在含968μl/m1N2、

2、10μl/m1827、20ng/ml表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、20ng/ml堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、2μg/ml肝素及1％青鏈霉素的無血清DMEM/F12完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)和傳代。取第3代視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞作為研究對(duì)象，隨機(jī)分為三組：①RPC對(duì)照組：繼續(xù)原完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；②胎牛血清誘導(dǎo)組：在原完全培養(yǎng)基中去除EGF、bFGF

3、和肝素并加入10％胎牛血清；③全反式視黃酸（ATRA）誘導(dǎo)組：在原完全培養(yǎng)基中去除EGF、bFGF和肝素并加入1％胎牛血清及0.5μmol/L全反式視黃酸誘導(dǎo)分化。孵育七天后觀察細(xì)胞形態(tài)變化，采用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測神經(jīng)干/前體細(xì)胞的標(biāo)記物巢蛋白Nestin、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神經(jīng)元標(biāo)記物β-微管蛋白（β-Tubulin）、光感受器細(xì)胞不同發(fā)育

4、階段的標(biāo)記物視錐-視桿細(xì)胞同源異型基因（cone-rod homeobox gene，CRX）、恢復(fù)蛋白R(shí)ecoverin及視紫紅質(zhì)Rhodopsin的表達(dá)，分別比較三組間各種標(biāo)記物表達(dá)的陽性率。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse-transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測三組細(xì)胞中成對(duì)同源異形盒轉(zhuǎn)錄因子6（paired box6，Pax6）mRNA的表達(dá)含量，分析全反式視黃

5、酸對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞向光感受器細(xì)胞分化的誘導(dǎo)效應(yīng)。 結(jié)果： 1.視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化后的免疫熒光鑒定結(jié)果： ①對(duì)照組：在未經(jīng)誘導(dǎo)的對(duì)照組，細(xì)胞多呈集落生長，少部分單個(gè)貼壁，形態(tài)以橢圓形或三角形為主，有兩到三個(gè)短的突起，胞核較大，呈圓形，胞質(zhì)較少，79.5％細(xì)胞為Nestin陽性表達(dá)細(xì)胞，即神經(jīng)前體細(xì)胞；GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達(dá)細(xì)胞百分比分別為15

6、.8％、13.4％、10.9％、10.1％和8.9％。 ②胎牛血清誘導(dǎo)組：視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞經(jīng)10％FBS誘導(dǎo)7天后，光鏡下見細(xì)胞呈單個(gè)貼壁生長，部分細(xì)胞胞體扁平，形態(tài)不規(guī)則，似膠質(zhì)細(xì)胞。部分細(xì)胞伸出一個(gè)或多個(gè)突起，突起與突起相接觸。Nestin陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，而GFAP陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目顯著增加，β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，有顯著差異（P<0.05）。其

7、中Nestin、GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達(dá)細(xì)胞百分比分別為16.0％、70.9％、21.2％、18.8％、18.7％和17.9％。 ③ATRA誘導(dǎo)組：視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞經(jīng)0.5μM全反式視黃酸誘導(dǎo)7天后，細(xì)胞呈單個(gè)貼壁生長，部分細(xì)胞伸出一個(gè)或兩個(gè)較長突起，突起間互相接觸。β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，有顯著性

8、差異（P<0.05）。Nestin、GFAP、β-Tubulin、CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達(dá)細(xì)胞百分比分別為14.1％、23.2％、64.7％、61.2％、59.2％和55.4％。 對(duì)照組大部分細(xì)胞仍然表達(dá)nestin，而胎牛血清組和ATRA組nestin陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著減少（P<0.05）；胎牛血清組GFAP陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量顯著增多（P<0.05），是對(duì)照組的4.49倍；ATRA組早期神經(jīng)元β-

9、Tubulin陽性細(xì)胞明顯增多（P<0.05），是對(duì)照組的4.83倍。ATRA組的光感受器標(biāo)記CRX、Recoverin及Rhodopsin陽性表達(dá)細(xì)胞分別為對(duì)照組的5.61、5.86和6.22倍。 2.PAX6 mRNA的表達(dá)：視網(wǎng)膜神經(jīng)前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化后，凝膠電泳圖分析檢測發(fā)現(xiàn)：ATRA誘導(dǎo)組PAX6表達(dá)量最少，胎牛血清組其次，對(duì)照組Pax6表達(dá)量最多。 結(jié)論： 0.5μM全反式視黃酸在體外能有效誘導(dǎo)新生SD