骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為光感受器樣細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞（MesenchymAlStem Cells， MSCs）是一多能干細(xì)胞，具有定向誘導(dǎo)分化為多種組織的潛力。最近研究表明誘導(dǎo)后的MSCs可表達(dá)視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞特異性標(biāo)志物。因此，研究MSCs定向誘導(dǎo)分化為光感受器樣細(xì)胞為干細(xì)胞移植治療視網(wǎng)膜變性疾病奠定基礎(chǔ)。目前，對MSCs的特征及其誘導(dǎo)分化為光感受器樣細(xì)胞的蛋白調(diào)控機(jī)制還不清楚。本研究模擬視網(wǎng)膜體內(nèi)生存的微環(huán)境，將人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone MesenchymAlSte

2、m Cells，BMSCs）誘導(dǎo)分化成視網(wǎng)膜光感受器樣細(xì)胞，建立BMSCs誘導(dǎo)分化為光感受器樣細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)庫，探討B(tài)MSCs誘導(dǎo)分化為光感受器樣細(xì)胞的分化標(biāo)記和蛋白質(zhì)調(diào)控機(jī)制。
　　
　　 第一部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為光感受器樣細(xì)胞
　　 目的：研究BMSCs在體外定向分化為光感受器樣細(xì)胞及光感受器細(xì)胞特異性標(biāo)志物視紫紅質(zhì)、恢復(fù)蛋白的表達(dá)情況。
　　 方法：取第2～4代的人BMSCs細(xì)胞株

3、及第3代RPE細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分兩組：誘導(dǎo)組和對照組。誘導(dǎo)組：BMSCs與20ng/mlbFGF、20ng/mlEGF及20ng/mlBDNF的MSCM及RPE細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。對照組：單純使用配制好的MSCM培養(yǎng)。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測不同誘導(dǎo)時間（3d、5d、7d）視紫紅質(zhì)蛋白的陽性表達(dá)率。 Realtime-PCR方法檢測誘導(dǎo)7d后細(xì)胞視紫紅質(zhì)、恢復(fù)蛋白mRNA的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測第3d即有視紫紅

4、質(zhì)表達(dá)，第7d視紫紅質(zhì)陽性率為（29.8±2.3)％，對照組均未檢測到視紫紅質(zhì)表達(dá)。誘導(dǎo)組均較對照組有顯著性差異，p<0．01。在誘導(dǎo)7d后采用Realtime-PCR方法檢測到誘導(dǎo)細(xì)胞有視紫紅質(zhì)、恢復(fù)蛋白mRNA的表達(dá)，對照組未見視紫紅質(zhì)、恢復(fù)蛋白mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)論：本研究證實(shí)采用含有細(xì)胞因子的培養(yǎng)液及RPE細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，BMSCs在體外能夠誘導(dǎo)分化成光感受器樣細(xì)胞，表達(dá)其特異性標(biāo)志物視紫紅質(zhì)、恢復(fù)蛋白。
　　

5、 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化為光感受器樣細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究
　　 目的：研究體外BMSCs向光感受器樣細(xì)胞分化過程中的差異蛋白質(zhì)，探討B(tài)MSCs定向分化的標(biāo)記和蛋白調(diào)控機(jī)制。
　　 方法：取第4～6代的人BMSCs細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)誘導(dǎo)分化同前。實(shí)驗(yàn)分兩組：MSCs組和誘導(dǎo)組（誘導(dǎo)后7d的細(xì)胞）。通過2D-DIGE雙向電泳技術(shù)及MALDI-TOF-MS分析，共鑒定出32個差異表達(dá)蛋白。Western-

6、blot進(jìn)一步驗(yàn)證了Zyxin、β-tropomyosin的差異表達(dá)。
　　 結(jié)果：共鑒定出32個差異表達(dá)蛋白，其中11個蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)，21個蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，建立了BMSCs向光感受器樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化7d后的差異表達(dá)蛋白譜。鑒定出的蛋白質(zhì)分為7類：細(xì)胞骨架蛋白、分子伴侶、能量代謝的激酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白、細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)蛋白、鈣結(jié)合蛋白和離子通道及其他蛋白。研究發(fā)現(xiàn)β-tropomyosin、p38、人類增殖細(xì)胞核抗