TERT促耳蝸前體細(xì)胞增殖及其機(jī)制研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物耳蝸毛細(xì)胞為終末感覺細(xì)胞，一旦損傷便難以再生，利用潛在的內(nèi)源性干細(xì)胞替代損傷毛細(xì)胞可能成為最有潛力的治療策略。近年來(lái)，研究者們已經(jīng)成功的從出生后早期的哺乳動(dòng)物耳蝸中分離出具有干細(xì)胞功能的耳蝸前體細(xì)胞，并證實(shí)其在體外增殖，并可誘導(dǎo)分化成為毛細(xì)胞樣細(xì)胞。然而耳蝸前體細(xì)胞并非真正意義上的干細(xì)胞，而是介于干細(xì)胞和終末細(xì)胞之間的一類細(xì)胞亞型，其增殖能力有限，隨著細(xì)胞的有絲分裂而逐漸退出細(xì)胞周期。因此，如何維持耳蝸前體細(xì)胞的增殖能力成為研究

2、的焦點(diǎn)。隨著耳聾基礎(chǔ)研究的深入，一些耳蝸發(fā)育相關(guān)的基因已被證實(shí)可以促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞的增殖，在研究中我們檢測(cè)了在SD大鼠耳蝸發(fā)育過(guò)程和體外培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞中 TERT的表達(dá)變化，結(jié)果提示隨著耳蝸的發(fā)育和耳蝸前體細(xì)胞增殖能力的降低 TERT的表達(dá)逐漸降低。通過(guò)腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將TERT轉(zhuǎn)染進(jìn)入體外培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞，證實(shí)過(guò)表達(dá)TERT可以促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞的增殖，并初步證實(shí)Rb/E2F信號(hào)通路可能參與了TERT對(duì)耳蝸前體細(xì)胞增殖的調(diào)控。

3、>　　實(shí)驗(yàn)一新生 SD大鼠耳蝸前體細(xì)胞的分離、培養(yǎng)
　　目的：
　　采用聯(lián)合酶消化的方法建立新生大鼠耳蝸前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，以改善原有耳蝸前體細(xì)胞的分離、培養(yǎng)方法；
　　方法：
　　分離P1-P3 SD大鼠耳蝸基底膜，將基底膜分為四組，分別為：A組：嗜熱菌蛋白酶消化組；B組：Ⅰ型膠原酶消化組；C組：嗜熱菌蛋白酶和Ⅰ型膠原酶消化組；D組：嗜熱菌蛋白酶消化+機(jī)械分離組。根據(jù)不同的分組進(jìn)行酶消化和細(xì)胞分離，收集細(xì)胞

4、進(jìn)行懸浮培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化，觀察培養(yǎng)獲得的細(xì)胞球數(shù)目，上皮細(xì)胞的純度、細(xì)胞的增殖和定向分化能力。
　　結(jié)果：
　　從4種方法分離得到的細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)后均可形成細(xì)胞球，表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物Nestin和細(xì)胞分裂標(biāo)記物BrdU。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)分化后基底膜上皮細(xì)胞可以分化成毛細(xì)胞樣細(xì)胞和支持細(xì)胞，而間質(zhì)細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。采用嗜熱菌蛋白酶和Ⅰ型膠原酶聯(lián)合消化可以獲得最多數(shù)量的細(xì)胞球，并證實(shí)這些細(xì)胞球?yàn)樯掀?lái)源，各組細(xì)胞的上皮細(xì)胞陽(yáng)性率無(wú)顯著

5、差異。
　　結(jié)論：
　　采用嗜熱菌蛋白酶和Ⅰ型膠原酶聯(lián)合消化基底膜可以獲得較高純度的上皮細(xì)胞，顯著提高耳蝸前體細(xì)胞的分離效率，該方法改善了原有耳蝸前體細(xì)胞的培養(yǎng)方法，為耳蝸前體細(xì)胞的研究提供了有力工具。
　　實(shí)驗(yàn)二 TERT在耳蝸發(fā)育過(guò)程中及耳蝸前體細(xì)胞增殖中的表達(dá)
　　目的：
　　TERT對(duì)于維持端粒酶活性具有關(guān)鍵作用，已被證實(shí)可以促進(jìn)多種細(xì)胞的增殖，而其在內(nèi)耳細(xì)胞中的作用并不清楚。該實(shí)驗(yàn)的目的是檢測(cè) T

6、ERT在大鼠耳蝸發(fā)育過(guò)程中及耳蝸前體細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的表達(dá)變化。
　　方法：
　　我們采用分別RT-PCR和Western blot檢測(cè)了TERT在P0，P3，P7，P14，P28 SD大鼠耳蝸基底膜中的表達(dá)變化。同時(shí)分離培養(yǎng)大鼠耳蝸前體細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)了在不同培養(yǎng)時(shí)間，不同細(xì)胞球類型及不同傳代的前體細(xì)胞中 nestin，PCNA及TERT的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　在出生后早期可以見到基底膜中有較低水

7、平的 TERT的表達(dá)，隨著耳蝸發(fā)育其表達(dá)水平逐漸降低。體外培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞傳代，其nestin，PCNA及TERT的表達(dá)逐漸下降，鏤空細(xì)胞球中TERT的表達(dá)水平顯著低于混合性細(xì)胞球組及實(shí)性細(xì)胞球組。
　　結(jié)論：
　　TERT在出生后早期可有較低水平的表達(dá)，而隨著耳蝸的發(fā)育其表達(dá)逐漸降低，提示 TERT可能與耳蝸的發(fā)育有關(guān)。耳蝸前體細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)及傳代其增殖能力和干細(xì)胞特性降低，同時(shí)伴有TER

8、T的表達(dá)下降，提示TERT可能與耳蝸前體細(xì)胞干細(xì)胞功能的維持有關(guān)。
　　實(shí)驗(yàn)三 Ad-TERT-EGFP的構(gòu)建和大鼠耳蝸前體細(xì)胞的轉(zhuǎn)染
　　目的：
　　構(gòu)建攜帶目的基因?yàn)?TERT的腺病毒載體，體外轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的大鼠耳蝸前體細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞狀態(tài)，確定適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)染滴度。
　　方法：
　　1、構(gòu)建復(fù)制缺陷重組腺病毒：Ad-TERT-EGFP及Ad-EGFP;
　　2、應(yīng)用不同感染復(fù)數(shù)的Ad-EGFP（M

9、OI=250、200、150、100、50、25）轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞，觀察不同滴度轉(zhuǎn)染時(shí)前體細(xì)胞形態(tài)的變化，熒光顯微鏡觀察EGFP表達(dá)情況，確定轉(zhuǎn)染MOI值，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率；
　　3、應(yīng)用 RT-PCR、Western blot檢測(cè) Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染后耳蝸前體細(xì)胞中TERT的表達(dá)情況，用TRAP-ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后耳蝸前體細(xì)胞中端粒酶活性的變化。
　　結(jié)果：
　　收集病毒上清液經(jīng)過(guò)鑒定，證實(shí)該重組腺病

10、毒攜帶目的基因片段，病毒滴度為1×1011pfu/ml。在不同的感染復(fù)數(shù)下，EGFP的陽(yáng)性細(xì)胞的比例隨著 MOI值增加而不斷升高，當(dāng)MOI值等于或者低于200時(shí)，病毒轉(zhuǎn)染組與對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異。而當(dāng)MOI>250時(shí)，病毒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)貼壁，生長(zhǎng)抑制，壞死。確定本實(shí)驗(yàn) MOI值為200，轉(zhuǎn)染后3-4天轉(zhuǎn)染效果達(dá)到最佳，轉(zhuǎn)染效率為32.15±3.12％。以 MOI=200將 Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞，RT-PCR和We

11、stern blot檢測(cè)耳蝸前體細(xì)胞中TERT mRNA和蛋白的表達(dá)顯著升高，而端粒酶活性卻沒(méi)有顯著變化。
　　結(jié)論：
　　應(yīng)用腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)可以成功轉(zhuǎn)染耳蝸前體細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后前體細(xì)胞中TERT的表達(dá)顯著升高，為進(jìn)一步研究TERT對(duì)耳蝸前體細(xì)胞增殖能力的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　實(shí)驗(yàn)四過(guò)表達(dá) TERT對(duì)耳蝸前體細(xì)胞增殖能力的影響
　　目的：
　　通過(guò)攜帶TERT的腺病毒將TERT轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的耳蝸前體細(xì)胞，觀察

12、過(guò)表達(dá)TERT后耳蝸前體細(xì)胞增殖能力的改變。
　　方法：
　　將耳蝸前體細(xì)胞分成三組：Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染組；Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組；對(duì)照組，對(duì)各組細(xì)胞分別進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染，MOI=200，然后分別計(jì)數(shù)耳蝸前體細(xì)胞各類細(xì)胞球所占比例，MTT繪制生長(zhǎng)曲線，EdU染色、RT-PCR及Western blot檢測(cè)前體細(xì)胞中PCNA的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　結(jié)果表明進(jìn)行Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染后7天，耳蝸前體細(xì)胞中

13、實(shí)性細(xì)胞球所占比例比Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組顯著升高（P<0.05)，MTT結(jié)果也提示過(guò)表達(dá)TERT后，耳蝸前體細(xì)胞的增殖能力顯著增強(qiáng)。EdU染色提示Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染組耳蝸前體細(xì)胞中 EdU陽(yáng)性的細(xì)胞百分率顯著高于 Ad-EGFP組及對(duì)照組，RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染組中PCNA的表達(dá)顯著高于Ad-EGFP組及對(duì)照組。
　　結(jié)論：
　　過(guò)表達(dá)TERT可以促進(jìn)耳

14、蝸前體細(xì)胞的增殖。
　　實(shí)驗(yàn)五 TERT促進(jìn)耳蝸前體細(xì)胞增殖的機(jī)制
　　目的：
　　研究轉(zhuǎn)染Ad-TERT-EGFP耳蝸前體細(xì)胞后促進(jìn)前體細(xì)胞增殖的可能機(jī)制。
　　方法：
　　應(yīng)用 RT-PCR檢測(cè) Ad-TERT-EGFP轉(zhuǎn)染組，Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組中P27KIP1、P53、Rb、E2F、β-catenin、Cyclin D1、Cyclin E1、CDK2、CDK4、P16INK4a mRNA的表

15、達(dá)水平變化，采用Western blot檢測(cè)P27KIP1、P53、Rb、E2F、Cyclin D1、β-catenin蛋白的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：
　　RT-PCR結(jié)果提示過(guò)表達(dá) TERT后，耳蝸前體細(xì)胞中 P27KIP1、P53、P16INK4a表達(dá)水平較Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組顯著降低（P<0.05），而CDK2、Cyclin D1的表達(dá)較 Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及對(duì)照組升高。Western blot結(jié)果提示：過(guò)