刺參巖藻多糖對神經(jīng)干-前體細(xì)胞的增殖作用及其機(jī)制研究.pdf

1、刺參(Stichopus japonicus)，歸屬于無脊椎動(dòng)物棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海參綱(Holothurioider)刺參科(Stichopodidae)。自古以來，海參不僅被冠為海八珍之首，而且歷來被認(rèn)為是一種藥食兩用的滋補(bǔ)品。刺參多糖類物質(zhì)具有廣泛的生物學(xué)活性，諸如抗凝血、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、抗病毒、調(diào)節(jié)脂類代謝以及組織發(fā)生等。近年來，硫酸化多糖對神經(jīng)干/前體細(xì)胞(NSPCs)發(fā)育的影響成為神經(jīng)生物學(xué)及糖生物

2、學(xué)研究的新熱點(diǎn)。硫酸化多糖作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分，其在神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化和遷移等過程中發(fā)揮極其重要的調(diào)節(jié)作用。然而，單純的硫酸化多糖，特別是海洋生物來源的酸性硫酸化多糖對NSPCs發(fā)育的研究較少。
　　 我們從鮮刺參體壁中分離純化得到單一組分的巖藻多糖(HS)，對其理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；研究HS對NSPCs存活、增殖、聚集和凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HS明顯地促進(jìn)神經(jīng)球的形成；并進(jìn)一步探討其促進(jìn)NSPCs形成

3、神經(jīng)球的原因以及可能的作用機(jī)制。期望為深入認(rèn)識硫酸化多糖在CNS中的生物學(xué)功能提供新的線索，同時(shí)為NSPCs移植用于神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病及CNS損傷的臨床治療提供一些新的思路。本論文的研究內(nèi)容和結(jié)果主要有以下幾個(gè)方面。
　　 1.刺參巖藻多糖的提取、純化以及活性多糖組分的篩選首先采用胃蛋白酶/胰蛋白酶雙酶解，60％乙醇沉淀獲得刺參粗多糖。經(jīng)大孔吸附樹脂柱脫色后，采用DEAE-Sepharose柱進(jìn)行第一次分離純化。用2M氯化鈉溶液

4、進(jìn)行線性洗脫，紫外210nm、280nm結(jié)合苯酚硫酸法監(jiān)測流出的各組分，得到A、B、C、D四個(gè)糖組分，然后將有活性的組分(組分D)用Superdex200柱進(jìn)行二次分離純化。用0.15mol/L氯化鈉溶液洗脫，紫外210nm和280nm同時(shí)監(jiān)測，收集各組分，再利用Sephadex G-25柱脫鹽，最后冷凍干燥得到活性組分HS。粗多糖(CHS)得率為0.23％，精制多糖(FHS)得率為0.053％。
　　 2.刺參巖藻多糖(HS)

5、理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的分析凝膠過濾法和紫外掃描初步確定HS為均一物質(zhì)，分子量為4.23×105Da。HS為白色絮狀物，無色、無味，易吸濕；不含蛋白質(zhì)和核酸。HS中巖藻糖含量為38.12％，糖醛酸含量為16.52％，硫酸基含量為32.64％。單糖組成分析結(jié)果表明，HS含有巖藻糖，且相對含量較高；微量的半乳糖，巖藻糖與半乳糖的摩爾比為14.29。紅外光譜(IR)顯示HS具有硫酸化多糖的特征吸收峰，即1250.96cm-1的S=O的伸縮振動(dòng)峰和85

6、0.78 cm-1的C-O-S的伸縮振動(dòng)峰，且提示HS由β-D-吡喃糖組成。1HNMR及13CNMR波譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步提示HS中糖殘基可能為β-構(gòu)型。
　　 3.刺參巖藻多糖(HS)對體外培養(yǎng)NSPCs的增殖作用首先，建立NSPCs懸浮培養(yǎng)體系。采用酶解與機(jī)械吹打相結(jié)合的方法從孕14天大鼠的大腦皮質(zhì)分離NSPCs，以無血清懸浮培養(yǎng)方式體外培養(yǎng)NSPCs并形成神經(jīng)球，確定適合的種板密度(2-3x105cells/mL)、培養(yǎng)時(shí)間(72

7、-96 h)以及HS的劑量范圍；采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對其干細(xì)胞特性和多向分化潛能進(jìn)行鑒定。然后，通過MTT法、BrdU摻入法以及神經(jīng)球形成實(shí)驗(yàn)測定HS對NSPCs的增殖作用。結(jié)果表明HS能夠以劑量依賴性的方式增加NSPCs的活力；在與生長因子同時(shí)作用時(shí)，HS可以增加FGF-2對細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用，而對于EGF的增殖作用沒有影響。BrdU摻入法證實(shí)了HS能夠促進(jìn)NSPCs的增殖，并且與FGF-2具有協(xié)同性。在較高濃度范圍(1-8μg/mL

8、)內(nèi)，單獨(dú)的HS能夠以劑量依賴性的方式促進(jìn)NSPCs形成神經(jīng)球。同樣，HS可以增加FGF-2對于神經(jīng)球形成的促進(jìn)作用。HS與FGF-2協(xié)同促進(jìn)神經(jīng)球形成的有效劑量在4-8μg/mL之間。有血清培養(yǎng)條件下，HS同樣可以促進(jìn)神經(jīng)球的形成，但神經(jīng)元突起數(shù)量減少，神經(jīng)球之間聯(lián)系更加直接。最后，采用Hoechst33342/PI雙染法檢測HS對NSPCs凋亡的作用。結(jié)果顯示，在HS和/或FGF-2各個(gè)處理組中，沒有凋亡的細(xì)胞出現(xiàn)。
　　

9、4.刺參巖藻多糖(HS)促進(jìn)神經(jīng)球形成的內(nèi)在機(jī)制實(shí)驗(yàn)中我們觀察到HS處理組細(xì)胞形成神經(jīng)球的時(shí)間要早于對照組；同時(shí)，在有血清培養(yǎng)條件下，HS也可以促進(jìn)已經(jīng)分化的細(xì)胞聚集形成細(xì)胞團(tuán)。從以上兩方面綜合分析，我們認(rèn)為HS促進(jìn)NSPCs形成神經(jīng)球并不僅僅是由增殖作用引起的。因此，進(jìn)一步從細(xì)胞聚集方面分析HS促進(jìn)神經(jīng)球快速形成的原因。結(jié)果表明，在NSPCs培養(yǎng)初期，HS能夠促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞聚集，促使3-5個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)生成，這種微環(huán)境的形成有利于NSP

10、Cs進(jìn)一步的增殖，從而加速了神經(jīng)球的形成。但HS誘導(dǎo)的NSPCs聚集及運(yùn)動(dòng)性的影響不能用趨化性遷移來解釋。進(jìn)一步的細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HS能夠促使更多的細(xì)胞進(jìn)入S期，HS處理組的S-期細(xì)胞數(shù)是對照組的2.8倍，加速細(xì)胞增殖。也就是說，HS的促增殖以及促聚集作用共同促進(jìn)了神經(jīng)球的快速生成，因此，HS有可能成為促進(jìn)NSPCs增殖以及神經(jīng)球形成的良好輔助分子。
　　 5.刺參巖藻多糖(HS)對NSPCs的作用與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的激活

11、有關(guān)NF-κB廣泛地存在于神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)保護(hù)以及突觸可塑性等方面具有重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道NF-κB信號途徑可以調(diào)節(jié)細(xì)胞對于有絲分裂原的反應(yīng)，而且TNF-α誘導(dǎo)的NSPCs聚集及增殖是通過NF-κB信號途徑的激活實(shí)現(xiàn)的。因此，我們假定HS對于NSPCs增殖和聚集的作用是通過NF-κB的激活來實(shí)現(xiàn)的。采用NF-κB P65 ELISA檢測細(xì)胞核中P65蛋白的含量，以此表示轉(zhuǎn)錄因子的激活程度。結(jié)果顯示，在5-50μg/mL劑量范圍內(nèi)

12、，細(xì)胞核內(nèi)的P65蛋白含量以劑量依賴性方式增加；在50μg/mL濃度時(shí)，細(xì)胞核內(nèi)P65蛋白的含量比對照組增加了近50％，初步結(jié)果表明HS對NSPCs的作用與NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的激活有關(guān)。
　　 6.刺參巖藻多糖(HS)對NSPCs的作用并不影響神經(jīng)球的干細(xì)胞特性以及多向分化潛能HS來源于海洋無脊椎動(dòng)物，沒有潛在的病毒感染；更為重要的是HS抗凝活性較低，不易引起內(nèi)出血等不良反應(yīng)，有可能成為促進(jìn)NSPCs增殖以及神經(jīng)球形成的良好輔助

13、分子。因此，本文在研究發(fā)現(xiàn)HS促進(jìn)NSPCs增殖和神經(jīng)球形成的基礎(chǔ)上，對其誘導(dǎo)生成的神經(jīng)球干細(xì)胞特性及其多向分化潛能進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，HS并不改變神經(jīng)球的特征性蛋白Nestin的表達(dá)；經(jīng)HS(4μg/mL)誘導(dǎo)形成的神經(jīng)球仍具有多向分化潛能，可以分化成O4+的少突膠質(zhì)細(xì)胞、GFAP+的星型膠質(zhì)細(xì)胞以及MAP2+的神經(jīng)元。這些結(jié)果表明刺參巖藻多糖(HS)并不影響神經(jīng)球的干細(xì)胞特性及其多向分化潛能。
　　 本研究取得的成果和結(jié)論主

14、要有：
　　 (1)從刺參體壁中分離得到均一的硫酸化多糖組分HS，分子量為4.23×105Da，巖藻糖含量為38.12％，糖醛酸含量為16.52％，硫酸基含量為32.64％。
　　 (2)首次確定HS能夠促進(jìn)NSPCs增殖，并且與成纖維細(xì)胞生長因子(FGF-2)有協(xié)同作用。HS不會(huì)引起細(xì)胞凋亡。
　　 (3)首次確定HS能夠促進(jìn)NSPCs的聚集，在細(xì)胞培養(yǎng)初期能夠促進(jìn)神經(jīng)球的快速形成；同時(shí)促進(jìn)NSPCs分裂，使更