刺參多糖SJP對(duì)神經(jīng)細(xì)胞藥理活性的研究.pdf

1、研究目的：
　　刺參是海參的一種，它對(duì)人體不僅有滋補(bǔ)的功能，而且還有醫(yī)學(xué)和藥理的功效，可以說，海參是一種常見的傳統(tǒng)食品和民間藥物。刺參多糖有許多獨(dú)特的生物學(xué)和藥理學(xué)活性，包括抗凝血、抗血栓形成、抗腫瘤和抗骨性關(guān)節(jié)炎等。臨床試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)刺參多糖對(duì)于患有缺血性中風(fēng)和缺血性心肌炎的病人有很好的療效。由此可以得出，刺參多糖是一種可以應(yīng)用于治療腦缺血再灌注損傷的潛在藥物，但是其作用機(jī)理仍然不是很清楚。
　　缺氧損傷已經(jīng)涉及許多中樞神經(jīng)

2、系統(tǒng)(central nervous system，CNS)病理障礙，其中包括腦中風(fēng)、頭部外傷、腫瘤、血管畸形和神經(jīng)退行性疾病。永久性腦血流量減少將會(huì)引發(fā)腦缺血再灌注損傷，這一損傷將會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的功能紊亂和不可逆性壞死，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致機(jī)體的死亡。在通常情況下，再灌注被看作是一個(gè)不錯(cuò)的治療方案，然而有時(shí)候它也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腦損傷，例如:腦水腫、腦出血、神經(jīng)血管損傷、神經(jīng)壞死和炎癥反應(yīng)失控等等。到目前為止，還沒有一個(gè)很好的方法用于治療腦缺

3、血，大量的研究表明腦缺血再灌注損傷與細(xì)胞凋亡有著密切的聯(lián)系。缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷是缺血、呼吸功能紊亂和腫瘤惡化等疾病的一個(gè)重要病理因素，此外，H/R損傷也能夠誘發(fā)細(xì)胞損傷。
　　帕金森疾病(Parkinson's disease，PD)是存在于衰老個(gè)體當(dāng)中第二大常見的神經(jīng)退行性疾病，它極大影響著患者的生活質(zhì)量。在病理狀態(tài)下，PD是由黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損失所導(dǎo)致的運(yùn)動(dòng)功能障礙，其中包括

4、動(dòng)作遲緩，靜止震顫，肌肉僵硬，步態(tài)障礙和姿勢(shì)綜合征。然而，PD的發(fā)病原因我們并不完全理解，但是我們認(rèn)為氧化應(yīng)激，細(xì)胞周期和炎癥反應(yīng)在PD中起著重要的作用。
　　治療PD的傳統(tǒng)方法只能緩解癥狀，不能從根本上治愈神經(jīng)退行性病變的過程。研究證實(shí)硫酸軟骨素對(duì)于6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)損傷有明顯的保護(hù)作用。研究也證實(shí)刺參多糖SJP具有神經(jīng)保護(hù)的作用。SJP可以是一種治療PD的潛在海洋藥物，但是SJP發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通

5、路機(jī)制仍然不是很清楚。
　　盡管我們對(duì)腦中風(fēng)病理發(fā)展過程的理解有了重大的進(jìn)展，但是在腦血管疾病中的神經(jīng)障礙發(fā)病機(jī)理仍然不是很清楚。越來越多的學(xué)者認(rèn)為干細(xì)胞移植可以作為一個(gè)新的治療方法用于腦中風(fēng)。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)作為一類具有多分化潛能、自我更新能力的細(xì)胞，植入體內(nèi)能夠在損傷區(qū)域分化為成熟神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞譜系，并與宿主神經(jīng)有機(jī)整合，有效恢復(fù)亞急性期和慢性期損傷的神經(jīng)功能。未分化的NSC在多種CNS

6、疾病中都能夠有效的促進(jìn)腦損傷組織修復(fù)再生。細(xì)胞治療是安全可行的，但是神經(jīng)功能再生的機(jī)制不是很清楚。
　　細(xì)胞治療的優(yōu)點(diǎn)主要依靠注入細(xì)胞的正確遷移和歸巢。遷移是干細(xì)胞招募到特定區(qū)域的關(guān)鍵過程?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor1 alpha，SDF-1α)和它的受體CXC趨化受體4(CXC chemokine receptor4，CXCR4)在大腦CNS發(fā)展中起著很重要的作用，它能夠在神經(jīng)

7、修復(fù)過程中調(diào)控遷移。SDF-1α能夠在體內(nèi)和體外促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞(neural precursor cell，NPC)遷移并定點(diǎn)到達(dá)局灶性腦缺血部位，腦外傷的損傷區(qū)域或者急性神經(jīng)炎癥的病理部位。SDF-1α/CXCR4軸能夠促進(jìn)NSC的遷移并使神經(jīng)組織再生。
　　SJP是從刺參體壁分離純化得到的一種硫酸多糖。SJP能夠促進(jìn)神經(jīng)球的遷移并呈濃度梯度。然而，SJP對(duì)于NSC遷移和歸巢的細(xì)胞療法仍然不是很清楚。本課題的研究目的是研究SJ

8、P增強(qiáng)SDF-1α/CXCR4軸促進(jìn)NSC遷移的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1.驗(yàn)證SJP是否對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞H/R損傷有保護(hù)作用。
　　眾所周知，神經(jīng)嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞株具有交感神經(jīng)元的表型和生理特性，因此，PC12通常用作建立神經(jīng)元模型并進(jìn)行神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。用Na2S2O4處理細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞缺氧，從而建立體外氧消耗的模型。刺參多糖SJP是刺參的主要生物活性成分之一。在我們的論文中，我們用P

9、C12細(xì)胞來評(píng)價(jià)SJP對(duì)于Na2S2O4誘導(dǎo)H/R損傷的保護(hù)作用。在實(shí)驗(yàn)過程中，SJP對(duì)于Na2S2O4誘導(dǎo)PC12細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)效果我們從以下幾個(gè)方面進(jìn)行檢測(cè)。我們用MTT法檢測(cè)Na2S2O4誘導(dǎo)PC12細(xì)胞H/R損傷的細(xì)胞存活率。用LDH，SOD和MDA檢測(cè)法進(jìn)一步分析SJP對(duì)PC12細(xì)胞H/R損傷的保護(hù)作用。為了確定SJP是否可以阻斷Na2S2O4誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，我們?cè)跓晒怙@微鏡下觀察Hoechst33342/PI測(cè)定

10、的細(xì)胞凋亡率。為了檢測(cè)SJP對(duì)△ψm的影響，我們使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)JC-1的染色情況。SJP對(duì)于PC12細(xì)胞H/R損傷后的HIF-1α，cyto-c在胞漿和線粒體中的比率，Bax/Bcl-2比率，cl-casp-3/casp-3比率，p-p53和p53的影響是通過Westernblot方法進(jìn)行分析。
　　2.驗(yàn)證SJP是否對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的PD損傷有保護(hù)作用。
　　神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y是一個(gè)合適的模

11、型，它可以用于研究PD疾病細(xì)胞生物化學(xué)的各個(gè)方面。6-OHDA是最廣泛用于PD模型的神經(jīng)毒害藥物。因此，我們用6-OHDA處理SH-SY5Y細(xì)胞用于模擬PD的細(xì)胞模型。我們用倒置常光顯微鏡觀察SJP保護(hù)6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　結(jié)果：
　　1.SJP保護(hù)Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞H/R損傷。
　　SJP能夠有效的提高PC12細(xì)胞H/R損傷后的細(xì)胞存活率并且減低其導(dǎo)致的細(xì)胞外LD

12、H釋放。而且，SJP明顯增加SOD活性并降低MDA水平。SJP能夠有效提高H/R損傷誘導(dǎo)的△ψm損失。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SJP能夠明顯減低H/R損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。SJP壓制激活的MAPK信號(hào)通路，從而使Bax/Bcl-2比率和cl-casp-3/casp-3比率以及p-p53顯著減低，也會(huì)降低cyto-c在胞漿和線粒體的比率。這種抑制細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象呈現(xiàn)藥物濃度的依賴性。SB203580和SP600125能進(jìn)一步減低Bax/Bcl-2比

13、率，cl-casp-3/casp-3比率，p-p53和cyto-c在胞漿和線粒體的比率。然而，U0126對(duì)這些變化并沒有影響。 MAPK信號(hào)通路與H/R損傷緊密相連。SJP能夠抑制激活的p38和JNK MAPK，而對(duì)激活的ERK并沒有影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示p38和JNK MAPK信號(hào)通路參與SJP調(diào)解緩解的PC12細(xì)胞H/R損傷。SJP處理組與H/R處理組相比，HIF-1α表達(dá)情況并沒有區(qū)別。而且，SJP，SB203580，SP600125

14、和U0126對(duì)p53的表達(dá)并沒有影響。這說明SJP增強(qiáng)細(xì)胞存活和降低細(xì)胞凋亡并不是通過調(diào)節(jié)HIF-1α和p53來實(shí)現(xiàn)的。
　　2.SJP保護(hù)6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的PD損傷。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SJP有效減弱6-OHDA所導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞形態(tài)學(xué)破壞。而且，SJP明顯降低MDA水平。SJP對(duì)于6-OHDA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用與細(xì)胞周期G1/S相關(guān)并能阻斷CycIin D3蛋白的表達(dá)。與此同時(shí)，

15、SJP可以抵消激活的NF-κB信號(hào)通路并阻斷上調(diào)的iNOS蛋白表達(dá)和NO的釋放。我們的數(shù)據(jù)第一次證實(shí)SJP保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞免受6-OHDA損傷盡可能是與抑制NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　1.我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SJP能夠減少PC12細(xì)胞H/R損傷。這種保護(hù)效果可以修復(fù)神經(jīng)元的功能，促使氧化應(yīng)激趨于平衡并且顯示抗凋亡的特性。SJP保護(hù)Na2S2O4誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞H/R損傷是通過抑制激活的p38和JNK MA

16、PK信號(hào)通路并減低Bax/Bcl-2比率，cl-casp-3/casp-3比率，p-p53激活和cyto-c在胞漿和線粒體的比率。SJP抑制PC12細(xì)胞的H/R損傷呈現(xiàn)劑量依賴性，這些說明SJP可以發(fā)展成為一種預(yù)防和治療腦缺血再灌注損傷的新型藥物。
　　2.SJP能夠保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞免受6-OHDA誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)破壞。SJP可以抵御6-OHDA誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激和細(xì)胞周期，這一過程主要通過抑制激活NF-

17、κB信號(hào)通路:NF-κB激活會(huì)使iNOS上調(diào)并導(dǎo)致NO的釋放。因此，SJP是神經(jīng)退行性疾病PD的一種備選藥物。
　　3.我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SJP和SDF-1α處理NSC可以通過PI3K/Akt/FOXO3a，ERK/MAPK和NF-κB信號(hào)通路上調(diào)Nestin，N-cadherin，TLR4，TNF-α，Cyclin D1，EGFR，Alpha6 integrin，MMP-2，MMP-9和iNOS以及SDF-1α和CXCR4自身。