VKORC1和CYP2C9基因型對(duì)中國(guó)人華法林個(gè)體化用藥劑量影響的前瞻性研究.pdf

1、背景與目的： 華法林是一種雙香豆素衍生物，自20世紀(jì)40年代發(fā)明以來(lái)，由于其有效的抗凝作用和低廉的價(jià)格，至今仍是臨床上使用最多的口服抗凝藥物。但華法林的有效血藥濃度范圍狹窄，劑量偏小會(huì)降低治療血栓形成的效果，劑量偏大則會(huì)增大出血的風(fēng)險(xiǎn)，甚至引發(fā)大出血等副作用。應(yīng)用華法林抗凝治療的同時(shí)，也成倍地增加了患者出血的發(fā)生率，甚至危及生命，尤其是在治療初期的數(shù)周到數(shù)月內(nèi)。使用華法林的另一個(gè)特點(diǎn)是其穩(wěn)定劑量在不同種族間及個(gè)體間存在著較大差異

2、，不同個(gè)體間穩(wěn)定劑量的差異可達(dá)20倍以上。因此，將不同患者的華法林劑量調(diào)整到既安全又有效的范圍，是長(zhǎng)期以來(lái)臨床用藥上一個(gè)非常棘手的問(wèn)題。 造成華法林用量個(gè)體差異的原因很多，可分為非遺傳因素和遺傳因素。非遺傳因素主要有年齡、性別、體表面積、藥物的相互作用、飲食習(xí)慣和疾病狀態(tài)等。然而，非遺傳因素的影響程度較為有限，并非華法林用量個(gè)體差異的主要原因。近年來(lái)，隨著藥物基因組學(xué)的進(jìn)展和華法林藥理作用分子機(jī)制的闡明，遺傳因素在華法林用量個(gè)體

3、差異中的作用越來(lái)越受到人們的重視。目前，已知與華法林的藥效學(xué)和藥動(dòng)學(xué)相關(guān)的基因達(dá)30余種，其中維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合體亞單位1基因(VKORC1)的基因多態(tài)性和細(xì)胞色素P4502C9基因(CYP2C9)是影響華法林用量個(gè)體差異最主要的兩個(gè)遺傳因素。 維生素K環(huán)氧化物還原酶(VKOR)是華法林作用的靶蛋白。華法林通過(guò)抑制VKOR，使無(wú)活性的氧化型(還氧化物型)VK無(wú)法還原為有活性的還原型(氫醌型)VK而起到抗凝作用。多個(gè)VKO

4、RC1的SNP位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)與華法林用量個(gè)體差異相關(guān)，其中常見(jiàn)的兩個(gè)SNP是第一內(nèi)含子的1173C>T和3’UTR的3730G>A。這些SNP位點(diǎn)呈高度連鎖不平衡，經(jīng)單倍型分析分為A、B兩組單體型，A組(H1和H2)與華法林低劑量相關(guān)，B組(H7、H8和H9)與高劑量相關(guān)。CYP2C9是華法林最主要的代謝酶。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的CYP2C9的等位基因有30種，其中以*1(野生型)、*2(Arg144Cys)、*3(Ile359Leu)最為常

5、見(jiàn)。攜帶有變異性等位基因的患者，其華法林代謝酶的活性明顯低于野生型，并且，其出血的危險(xiǎn)性增加2～3倍。 最近已有學(xué)者對(duì)這兩個(gè)基因在華法林個(gè)體差異中的貢獻(xiàn)大小進(jìn)行了研究，這些研究顯示VKORC1和CYP2C9的多態(tài)性對(duì)華法林用量個(gè)體差異的貢獻(xiàn)比例分別6-37％和5-22％。近年來(lái)，一些針對(duì)特定人群，結(jié)合遺傳因素和非遺傳因素的華法林穩(wěn)定劑量預(yù)測(cè)算法相繼出現(xiàn)。但這些算法在廣泛應(yīng)用于臨床之前，必須進(jìn)行前瞻性的隨機(jī)病例-對(duì)照研究，以評(píng)價(jià)其

6、安全性和劑量預(yù)測(cè)的可靠性。目前，針對(duì)華法林的基于藥物基因組學(xué)的大樣本前瞻性研究?jī)H見(jiàn)于歐美國(guó)家白種人的報(bào)道，由于存在人種間的差異，有必要對(duì)其他種族人群特別是中國(guó)人進(jìn)行研究。與我們的研究幾乎同時(shí)進(jìn)行的只針對(duì)病例組的中國(guó)人群前瞻性研究報(bào)告最近剛發(fā)表(2008年1月)，我們?cè)谕ㄟ^(guò)大樣本回顧性研究建立華法林穩(wěn)定劑量測(cè)算法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步設(shè)計(jì)了中國(guó)人群的病例組和對(duì)照組的前瞻性臨床和實(shí)驗(yàn)研究。 目的： 中國(guó)人群作為研究對(duì)象，明確VKO

7、RC1和CYP2C9多態(tài)性與中國(guó)人華法林用量個(gè)體間差異的相關(guān)性，結(jié)合非遺傳因素，在回顧性研究的基礎(chǔ)上建立穩(wěn)定劑量預(yù)測(cè)算法；經(jīng)前瞻性隨機(jī)病例-對(duì)照研究評(píng)價(jià)該算法的實(shí)用性和可行性，探尋適合中國(guó)人群的華法林個(gè)體化用藥模式。此外，本研究還建立了一種基于熒光染料SYBRGreenI的real-timePCRSNP位點(diǎn)的基因分型方法，使其能夠達(dá)到簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的要求，適用于普通臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展基因分型。 設(shè)計(jì)與方法： 本研究?jī)?nèi)

8、容包括三部分內(nèi)容： (1)候選基因的選取，基因分型方法的建立和評(píng)價(jià)； (2)基于藥物基因組學(xué)的華法林個(gè)體化用藥的回顧性研究及穩(wěn)定劑量預(yù)測(cè)算法的建立； (3)基于藥物基因組學(xué)的華法林劑量預(yù)測(cè)算法指導(dǎo)臨床用藥的前瞻性隨機(jī)病例對(duì)照研究。 針對(duì)VKORC1T6484C和CYP2C9A1075C，兩個(gè)SNP位點(diǎn)，我們分別設(shè)計(jì)了基于DHPLC和基于熒光染料SYBRGreen-I的real-timePCR兩種基因分型方

9、法。以測(cè)序結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)這兩種方法的準(zhǔn)確性、所用時(shí)間和成本進(jìn)行比較，選擇較為快速、準(zhǔn)確、成本低廉的方法作用于本研究的基因分型。 在回顧性研究中，共266例已達(dá)穩(wěn)定劑量的臨床病人進(jìn)入研究計(jì)劃，我們?cè)敿?xì)記錄了患者的年齡、性別、身高、體重、吸煙、飲酒、同時(shí)服用的藥物和飲食習(xí)慣等。每例采集血樣2ml做基因分析。將各因素分別與穩(wěn)定劑量作相關(guān)性分析，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，剔除無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素，確定與華法林用量相關(guān)的因素。將有統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義的因素與穩(wěn)定劑量作多元回歸分析，得出決定系數(shù)R2，即各因素的總和能解釋華法林用量個(gè)體差異原因的比例。據(jù)此建立多元回歸方程作為華法林穩(wěn)定劑量的預(yù)測(cè)算法。 在前瞻性研究中，收集符合入選標(biāo)準(zhǔn)的同期初次服用華法林的病例112例，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組病。實(shí)驗(yàn)組病例服藥前先測(cè)定VKORC1和CYP2C9的基因型，代入華法林劑量預(yù)測(cè)算法計(jì)算出穩(wěn)定劑量，患者的前3次用藥按此劑量服藥，再以凝血酶原時(shí)間(prothrombintime，PT)

11、的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值(intemationalnormalizedratio，INR)的變化逐步調(diào)整至實(shí)際穩(wěn)定劑量；對(duì)照組按傳統(tǒng)方式用藥，并逐步調(diào)整至穩(wěn)定劑量。INR的監(jiān)測(cè)頻率為：從用藥開(kāi)始到出院期間為每天1次；出院后為每周1次，獲得穩(wěn)定劑量后為每月1次。詳細(xì)記錄到達(dá)穩(wěn)定劑量的天數(shù)，出現(xiàn)副作用的情況及時(shí)間。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用生存分析法處理。終點(diǎn)事件定為： (1)到達(dá)穩(wěn)定劑量的時(shí)間(天)； (2)到達(dá)出現(xiàn)副反應(yīng)(INR>3.5，出血或

12、靜脈栓塞)的時(shí)間(天)。 用log-rank檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組終點(diǎn)事件的差異；用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析各個(gè)因素對(duì)終點(diǎn)事件的影響以及實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組患者獲得穩(wěn)定劑量時(shí)間的風(fēng)險(xiǎn)比HR(hazardration)。 結(jié)果與討論： 本研究建立了兩種基于SNP位點(diǎn)的基因分型方法，即分別采用。DHPLC和real-timePCR對(duì)VKORCl和CYP2C9進(jìn)行基因分型的技術(shù)。兩種方法都具有很高的準(zhǔn)確性，DHPLC方法的

13、檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果的符合率為99％，而real-timePCR方法的檢測(cè)結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致。與DHPLC相比，real-timePCR方法更簡(jiǎn)便、省時(shí)和廉價(jià)，而且具有一定的通量，適合前瞻性研究中對(duì)VKORC1和CYP2C9基因型的快速檢測(cè)。 在回顧性研究中的266例患者中，華法林穩(wěn)定劑量的范圍是0.625～8.125mg/d，平均2.95±1.18mg/d，變異系數(shù)(CV)40％，最大劑量和最小劑量之間相差13倍。這進(jìn)一步證

14、實(shí)人群中華法林穩(wěn)定劑量確實(shí)存在很大的差異。在影響華法林用量個(gè)體差異的非遺傳因素中，我們選取性別、年齡、體表面積、吸煙、飲酒、是否伴有糖尿病、主要的治療疾病和平均INR等8種因素進(jìn)行分析。將這8種非遺傳因素分別與華法林穩(wěn)定劑量(經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換)進(jìn)行單因素相關(guān)分析，顯示性別、吸煙、飲酒、是否伴有糖尿病、主要的治療疾病5種等級(jí)因素與華法林穩(wěn)定劑量沒(méi)有顯著性相關(guān)關(guān)系，而年齡、體表面積和平均INR均與華法林穩(wěn)定劑量具有顯著的線(xiàn)性關(guān)系?；颊呷A法林的

15、穩(wěn)定劑量隨著年齡的增加而降低，在不考慮其他因素的情況下，從10到90歲，年齡每增加10歲，華法林穩(wěn)定劑量降低0.2mg，年齡對(duì)華法林用量個(gè)體差異的貢獻(xiàn)是7.1％。同樣，在不考慮其他因素的情況下，體表面積每增加1m2，華法林穩(wěn)定劑量增加1.54mg，體表面積對(duì)華法林用量個(gè)體差異的貢獻(xiàn)是4.9％。經(jīng)單因素相關(guān)性分析，VKORC1和CYP2C9兩個(gè)基因均與華法林穩(wěn)定劑量具有顯著性相關(guān)關(guān)系。在不考慮其他因素的情況下，VKORC1和CYP2C9對(duì)

16、華法林用量個(gè)體差異的貢獻(xiàn)分別是26.5％和21％。把單因素相關(guān)分析中與華法林穩(wěn)定劑量有顯著相關(guān)性的因素采用逐步回歸分析的方法，最后在多元回歸中對(duì)華法林用量個(gè)體差異有顯著影響的因素有年齡、體表面積、VKORC1和CYP2C9。根據(jù)最佳回歸模型得到的多元回歸方程即華法林穩(wěn)定劑量的預(yù)測(cè)算法，該方程可解釋華法林穩(wěn)定劑量個(gè)體差異54.1％的原因。 結(jié)論： 回顧性研究表明年齡、體表面積，以及VKORC1和CYP2C9多態(tài)性對(duì)華法林用