實(shí)驗(yàn)性靜脈血栓栓塞癥血管內(nèi)膜及生長(zhǎng)因子變化的研究.pdf

1、【背景】 靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism，VTE)包括肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism，PTE)和深靜脈血栓形成(deep vein thrombosis，DVT)，PTE是DVT的重要并發(fā)癥，DVT是PTE的主要栓子來(lái)源，二者有共同的危險(xiǎn)因素和治療，故應(yīng)將DVT和PTE作為一個(gè)疾病來(lái)研究。VTE是一個(gè)與多因素有關(guān)的疾病，基本病理生理仍遵循Virchow提出的三要素(血流

2、淤滯、血管壁損傷和血液高凝狀態(tài))，現(xiàn)代研究證明血管內(nèi)皮細(xì)胞微損傷和功能不全是血栓形成的核心，VTE的復(fù)發(fā)、血栓栓子的轉(zhuǎn)歸和慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓的發(fā)生均可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞微損傷和功能不全有關(guān)。本研究擬通過(guò)大鼠VTE模型，研究VTE的血管內(nèi)膜結(jié)構(gòu)、功能變化及其生長(zhǎng)因子的作用，以進(jìn)一步深入理解VTE的自然史和病理生理機(jī)制。 【目的】 1．建立大鼠VTE(DVT和PTE)模型，監(jiān)測(cè)急性PTE時(shí)循環(huán)和呼吸系統(tǒng)的病理生 理變化

3、。 2．觀察大鼠VTE股靜脈和肺動(dòng)脈血管內(nèi)膜的變化。3．測(cè)定大鼠VTE血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的變化，探討其對(duì)VTE病理的影響。 【方法】 1．分組：Sprague-Dawley大鼠120只，隨機(jī)分為DVT組(18只)和DVT-PTE組 (5

4、4只)、假手術(shù)(Sham)組(48只)。DVT組依據(jù)血栓形成持續(xù)時(shí)間1、4、7天不同分為DVTl、DV4T4、DVT7三個(gè)亞組簡(jiǎn)稱(chēng)(D1、D4、D7組)，每亞組6只；DVT-PTE組依據(jù)DVT時(shí)間(1、4、7天)不同和肺血栓栓塞癥的持續(xù)時(shí)間(1、4、7天)不同分為DVTl-PTEl、DVTl-PTE4、DVTl-PTE7、DVT4-PTEl、DVT4-PTE4、DVT4-PTE7、DVT7-PTE1、DVT7-PTE4、DVT7-PTE

5、7九個(gè)亞組(簡(jiǎn)稱(chēng)D1P1、D1P4、D1P7、D4P1、D4P4、D4P7、D7P1、D7P4、D7P7)，每亞組6只。Sham組依據(jù)上述相應(yīng)時(shí)間分為十二個(gè)亞組，每亞組4只。2．造模：采用顯微血管夾阻滯一側(cè)股靜脈血流，形成層狀血栓，制備DVT模型； 依據(jù)DVT不同時(shí)間，分離有血栓的股靜脈段，摘取血栓，通過(guò)套管針從另一 側(cè)股靜脈將血栓注入，制備DVT-PTE模型。 3．監(jiān)測(cè)各組平均肺動(dòng)脈壓力(mPAP)和平均右心室壓力(mRV

6、P)，行動(dòng)脈和混合靜 脈血?dú)夥治觥?4．各組肺組織和股靜脈切片HE染色觀察肺臟和血管病理變化，應(yīng)用 Cmias2001B型多功能真彩色病理圖像分析系統(tǒng)測(cè)量DVT-PTE各亞組栓塞和 非栓塞肺動(dòng)脈的管壁面積與血管面積比值和管壁厚與血管外徑比值。 5．電鏡下觀察DVT組股靜脈和DVT-PTE組肺動(dòng)脈血管內(nèi)膜變化。 6．采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組VEGF、bFGF在肺組織的表達(dá)部位及水平； 通過(guò)Western

7、 blot、RT-PCR方法半定量測(cè)定肺組織中上述二種因子的蛋白和 mRNA表達(dá)水平；利用ELISA方法測(cè)定血清中VEGF、bFGF濃度。 7．應(yīng)用方差分析和非參數(shù)檢驗(yàn)比較組間差異，并行相關(guān)和交互作用分析，p<0.05 為差異有顯著性。 【結(jié)果】 1．建立VTE大鼠模型： 下肢股靜脈顯微血管夾阻滯血流制備DVT模型成功率100％。54只大鼠DVT-PTE造模過(guò)程順利，D1P1組12小時(shí)死亡1只，解剖證

8、實(shí)死亡原因?yàn)榇竺娣ePTE。 2．PTE時(shí)循環(huán)和呼吸系統(tǒng)的病理生理改變：D1P1、D7P4組mPAP和mRVP升高，與Sham組比較差異有顯著性(p<0.05)。D4P4、D4P7、D7P1、D7P4和D7P7組動(dòng)脈血氧分壓(PaO<,2>)和混合靜脈血氧分壓(PvO<,2>)降低，與Sham組比較差異有顯著性(p<0.05)。DVT或PTE的病程是mPAP、mRVP和PaO<,2>的獨(dú)立影響因素(p<0.05)，二者交互作用對(duì)上

9、述指標(biāo)的影響有顯著性(p<0.01)；DVT或PTE的病程不是PvO<,2>的獨(dú)立影響因素，但二者的交互作用對(duì)PvO<,2>的影響有顯著性(p<0.01)。 3.PTE時(shí)栓塞肺動(dòng)脈與非栓塞肺動(dòng)脈的形態(tài)變化： DVT-PTE第1天栓塞肺動(dòng)脈的管壁面積與血管面積比值呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(0.52±0.05)，第4和7天則出現(xiàn)升高趨勢(shì)(分別為0.62±0.06和0.61±0.02)，但與Sham組(O.57±0.01)比較，差異沒(méi)有顯著性。D

10、VT-PTE 非栓塞肺動(dòng)脈的管壁面積與血管面積比值增加，其中D1P7、D4P4、D7P4和：D7P7組(分別為O.73±0.09；0.78±0.02；0.73±0.01；O.73±0.04)與Sham組(O.57±0.01)比較差異有顯著性(P＜0.05)。 4.大鼠VTE的病理改變：D1、D4和D7組股靜脈分別有紅色、混合、機(jī)化血栓形成，混合(DVT4天)和機(jī)化(DVT7天)血栓栓塞肺動(dòng)脈后，血栓溶解性降低，易發(fā)生機(jī)化，肺部炎

11、癥和肺泡出血面積增大，并累及近心端。 DVT組股靜脈：D1組內(nèi)皮細(xì)胞間連接斷裂，內(nèi)彈力板裸露，D4組內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、核增大，部分內(nèi)皮細(xì)胞和內(nèi)彈力板消失；D7組股靜脈血管壁結(jié)構(gòu)消失。DVT-PTE組肺動(dòng)脈：紅色(DVTl天)和混合(DVT4天)血栓栓塞肺動(dòng)脈第l天內(nèi)皮細(xì)胞腫脹、核增大；第4和7天內(nèi)皮細(xì)胞增生，內(nèi)彈力板增厚，成纖維細(xì)胞增生。而機(jī)化(DVT7天)血栓栓塞肺動(dòng)脈則可在第1天(D7P1組)即出現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體腫脹和內(nèi)彈力板消

12、失；第4和7天中膜增厚，成纖維細(xì)胞增生。 5.VTE時(shí)肺組織VEGF和bFGF的免疫組織化學(xué)分析：VEGF抗原：Sham組和DVT組主要在支氣管上皮胞漿表達(dá)，DVT-PTE組第1天肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞胞漿可見(jiàn)表達(dá)，第4天肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞胞漿可見(jiàn)表達(dá)，第4和7天機(jī)化栓子中成纖維細(xì)胞胞漿有表達(dá)。bFGF抗原：Sham組和DVT組主要由支氣管平滑肌和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿表達(dá)，DVT-PTE組第1天肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞漿表達(dá)增強(qiáng)，

13、第4和7天肺動(dòng)脈周?chē)|(zhì)和機(jī)化栓子內(nèi)成纖維細(xì)胞胞漿可見(jiàn)表達(dá)6.VTE時(shí)肺組織和血清VEGF和bFGF的變化：VEGF：Sham組和DVT組肺組織均有VEGF mRNA和蛋白表達(dá)，二者差異無(wú)顯著性；DVT-PTE組第1天肺組織VEGF mRNA和蛋白表達(dá)即升高并達(dá)峰值(1.07±0.03；1.64±O.11)，第7天VEGFmRNA(1.01±0.01)仍高于Sham組(0.66±0.02)(P＜0.01)，但蛋白表達(dá)量(1.22±O.1

14、8)與Sham組(1.00±0.00)比較差異不顯著。PTE的病程是VEGFmRNA和蛋白表達(dá)的獨(dú)立影響因素(P＜O.01)。VTE(DVT組和DVT-PTE組)血清VEGF濃度與Sham組比較差異無(wú)顯著性。 bFGF：Sham組和DVT組肺組織均有bFGF mRNA和蛋白表達(dá)，二者差異無(wú)顯著性；DVT-PTE組肺組織bFGF mRNA表達(dá)在第1天(1.42±0.09)開(kāi)始升高，第7天(1.54±0.08)仍持續(xù)升高，與Sham組(0.

15、84±0.09)比較差異有顯著性(p<0.01)。蛋白表達(dá)量在第7天(1.22±0.02)開(kāi)始升高，與Sham組(1V00±0.00)比較差異有顯著性(p<0.01)。PTE的病程是bFGFmP(NA和蛋白表達(dá)的獨(dú)立影響因素(p<0.05)。血清bFGF濃度在D1組[(40.18±3.89)pg/ml]升高，而在D7、D7P4和D7P7組降低[分別為(16.49±6.53)pg/ml、(11.01±0.40)pg/ml和(12.60±5

16、.22)pg／ml]，與Sham組[(25.59±6.06)pg/ml]比較差異均有顯著性(p<0.05)，DVT和PTE的病程是其獨(dú)立影響因素(p<0.05)，二者的交互作用對(duì)其影響有顯著性(P<0.05)。 [結(jié)論] 1.成功建立大鼠VTE模型： 采用顯微血管夾阻滯股靜脈血流，可制備理想的DVT動(dòng)物模型；將層狀血栓從一側(cè)股靜脈取出后，經(jīng)對(duì)側(cè)股靜脈注入可成功制備PTE動(dòng)物模型；由于模擬人的DVT——PTE過(guò)程，

17、因此是符合VTE病理生理的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?2．大鼠DVT不同時(shí)期血栓栓子的性質(zhì)直接影響PTE的轉(zhuǎn)歸： DVT不同時(shí)期血栓栓子的性質(zhì)可直接影響PTE血栓的轉(zhuǎn)歸(溶解、機(jī)化、再通或繼發(fā)血栓形成)以及肺動(dòng)脈和肺組織的病理改變；混合血栓栓塞肺動(dòng)脈第4和7天肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞增生，內(nèi)彈力板增厚，而機(jī)化血栓栓塞肺動(dòng)脈第1天即可引起內(nèi)皮細(xì)胞線粒體腫脹和內(nèi)彈力板消失；DVT和PTE的病程及其相互作用可共同影響大鼠PTE的循環(huán)和呼吸病理生理變