應(yīng)用MLST系統(tǒng)進行中國幽門螺桿菌的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、目的： 幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種螺旋狀、微需氧、革蘭陰性桿菌，屬于螺桿菌屬，定植于人胃黏膜表面。人類是其唯一的天然宿主，現(xiàn)已證實H.pylori感染與慢性胃炎、消化性潰瘍和胃黏膜相關(guān)組織淋巴瘤(MALT)的發(fā)生密切相關(guān)。幽門螺桿菌的致病性主要體現(xiàn)在毒力因子和機體的遺傳易感性兩個方面。人類對H.pylori普遍易感，但感染后的癥狀輕重各不相同，表現(xiàn)出明顯的致病性差異，輕者可長期無癥

2、狀攜帶，重者可引起慢性胃炎、潰瘍甚至胃部腫瘤。其原因與菌株型別的毒力強弱相關(guān)，和宿主的遺傳易感性有緊密的相關(guān)性，從而導(dǎo)致了H.pylori的感染致病存在人種、地域、環(huán)境衛(wèi)生、營養(yǎng)等顯著差異性。 近年來發(fā)展較快的分子生物學(xué)技術(shù)為細菌的分型提供了強大的工具，分型結(jié)果可達到基因水平。多位點序列分型(Multilocussequencetyping，MLST)具有很高的分辨能力，既適用于流行病學(xué)研究，也可用于分子進化學(xué)的研究.

3、因此，本研究擬應(yīng)用MLST系統(tǒng)對不同地區(qū)分離的H.pylori菌株進行基因水平的分型，確定不同地區(qū)感染H.pylori的主要類型，并與國際流行克隆株進行比較，了解它們的遺傳背景和可能的來源，使得流行病學(xué)研究可以從表型特征的鑒別深入到基因特征的鑒定，探索基因在核酸水平的變化過程。 方法： 1.收集4個不同地區(qū)(北京、重慶、廣州、上海)的幽門螺桿菌感染患者的臨床分離株。在患者進行胃鏡檢查時取胃竇部的活檢組織，標(biāo)本在含5％兔全

4、血的BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d.陽性菌株置于-70℃條件保存。 2.復(fù)蘇保存的H.pylori菌液，傳代培養(yǎng)后提取細菌基因組DNA，采用天成公司的細菌基因組DNA提取試劑盒進行操作。 3.根據(jù)文獻篩選幽門螺桿菌的8個看家基因作為MLST的目的基因，分別為atpA，efp，mutY，ppa，trpC，ureI，vacA，yphC。分別擴增8個基因的內(nèi)部核酸序列片段，從398bp～627bp。獲得的PCR擴增產(chǎn)物均進行核酸純化和

5、DNA序列分析。將DNA序列信息進行MLST分析，得到菌株的等位基因圖譜。確定H.pylori臨床分離株的序列分型(SequenceType，ST)，并與國際菌株進行比較。應(yīng)用BURST(BasedUponRelatedSequenceTypes)運算規(guī)則將菌株歸為各個譜系組(clonalcomplex)，應(yīng)用START程序計算相關(guān)系數(shù)(indexofassociation，Ia)并進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。 4.針對vacA基因信

6、號區(qū)及中間區(qū)序列設(shè)計引物，檢測H.pylori的等位基因，vacAs1a、vacAs1b、vacAs2、vacAm1、vacAm2。確定菌株所屬的vacA基因亞型。 結(jié)果： 1.PCR擴增所篩選的H.pylori的8個管家基因的核心核酸片段，對40株H.pylori臨床分離株進行MLST分析，8個基因座位多態(tài)性位點從atpA的1.77％到mutY的3.86％不等。一共獲得了38個STs序列型，均為在幽門螺桿菌MLST數(shù)據(jù)

7、庫中未報道的。 2.菌株核酸序列的ST型結(jié)果按類平均數(shù)聚類方法(UPGMA)繪制進化樹，得到的樣本菌株樹形聚類圖，顯示了菌株的親緣關(guān)系，可將40株H.pylori菌株大致分為三大類。 3.vacA基因分型結(jié)果，vacAs1a陽性為33株(82.5％)，vacAs1b陽性為7株(17.5％)，vacAm2陽性為39株(97.5％)，未發(fā)現(xiàn)s2型菌株，其中標(biāo)準(zhǔn)株NCTC11637和11638的結(jié)果為vacAs1a/ml型。

8、 結(jié)論： 1.首次應(yīng)用MLST的方法對中國4個大城市的H.pylori臨床分離株進行了研究，本實驗中等位基因的多樣性與H.pyloriMLST數(shù)據(jù)庫中之前的研究結(jié)果差異不大。所得到的STs序列型，不屬于原有的譜系。同時Singleton序列型在本實驗中占了大部分(95％)，與其它基因型相比它們代表了遺傳距離較遠的基因型。 2.對幽門螺桿菌菌株進行了vacA基因分型，結(jié)果以s1a/m2型為主，消化性潰瘍組與慢性胃炎組