實驗大小鼠螺桿菌流行病學調查及肝螺桿菌flaB基因的表達.pdf

1、嚙齒動物螺桿菌(Rodent Helicobacter)屬于螺桿菌菌屬(Helicobacter)，是一群革蘭氏染色陰性，微需氧條件生長且營養(yǎng)要求較高的螺旋狀細菌。主要以隱性感染形式普遍存在于大鼠、小鼠、沙鼠等嚙齒動物的消化道。不同株型的細菌在不同品系、年齡和免疫狀態(tài)的嚙齒動物中可引起宿主不同程度的病理反應從而導致盲腸結腸炎、肝炎、膽囊炎等各種組織炎癥甚至惡性腫瘤的發(fā)生，其中肝螺桿菌(Helicobacter hepaticus，H.h

2、epaticus)是目前研究較多的嚙齒動物螺桿菌，也是已明確具有致癌原的螺桿菌。動物感染螺桿菌后會改變各種免疫應答參數(shù)，干擾試驗結果。國外已有大量報道大小鼠種群螺桿菌有很高的感染比例，因此，建立快速診斷方法十分必要。
　　 世界各國及國際實驗動物理事會已將該類螺桿菌列為嚙齒實驗動物必須排除的病原微生物，而我國由于缺乏模式菌株和有效的檢測方法，至今尚未將其列入實驗動物質量國家標準。本研究從小鼠中分離培養(yǎng)了嚙齒動物螺桿菌；調查了上海

3、及周邊地區(qū)實驗大小鼠螺桿菌攜帶情況，為我國實驗動物螺桿菌等級及監(jiān)測標準的制定提供參考和依據(jù)；通過原核表達系統(tǒng)制備肝螺桿菌鞭毛蛋白重組抗原，以期作為建立ELISA診斷方法的候選抗原。
　　 1.肝螺桿菌的分離、培養(yǎng)及初步鑒定：從經(jīng)免疫抑制的SPF級C57BL/6小鼠回盲部取材接種哥倫比亞選擇性血平皿，將微需氧產(chǎn)氣袋置厭氧罐中制造出微需氧環(huán)境，37℃培養(yǎng)3～7d，經(jīng)過形態(tài)、生化及PCR擴增16SrRNA基因測序鑒定，呈現(xiàn)肝螺桿菌的典

4、型生物學特性，與GenBank庫中H.hepaticus16SrRNA(emb|AJ007931.1)基因序列進行比對，同源性達到98％，成功分離到一株H.hepaticus。
　　 2.上海及周邊地區(qū)實驗大小鼠螺桿菌攜帶情況調查：用PCR法測得實驗大鼠陽性率為70.3％(71/101)，其中清潔級、SPF級分別為69.6％(48/69)和71.9％(23/32)；實驗小鼠陽性率為35.8％(126/352)，其中清潔級、SPF

5、級陽性率分別為51.5％(52/101)和29.5％(74/251)；ELISA法測得實驗大鼠陽性率為52.7％(87/165)，其中清潔級、SPF級分別為53.6％(45/84)和51.9％(42/81)；實驗小鼠陽性率為15.9％(14/88)，其中清潔級、SPF級分別為19.2％(5/26)和14.5％(9/62)。用五種嚙齒動物螺桿菌特異性16SrRNA基因引物進一步分析，結果顯示在攜帶螺桿菌的107只小鼠及68只大鼠中，主要攜

6、帶的是H.rodentium、H.hepaticus和H.bilis三種。上述數(shù)據(jù)表明上海及周邊地區(qū)實驗大小鼠中皆存在不同程度的螺桿菌感染。
　　 3.肝螺桿菌flaB基因的表達、純化和抗體制備：根據(jù)GenBank公布的Hh ATCC51449 flaB基因序列(NC004917.1)，人工合成flaB全基因序列，PCR擴增后將目的片段插入pGEM-T載體，并測序鑒定。目的條帶亞克隆于原核表達載體pET-32a中，構建重組質粒p

7、ET-flaB，轉化E.coli BL21(DE3)，IPTG誘導表達，SDS-PAGE和Western blot鑒定表達產(chǎn)物，結果顯示融合蛋白約54KDa，以可溶性形式存在。經(jīng)Ni-NTA Agarose柱純化后的重組蛋白免疫BALB/c小鼠，制備抗重組flaB蛋白血清，采用Hh全菌抗體的Western blot和鼠抗重組flaB蛋白血清的間接ELISA試驗鑒定重組蛋白的免疫反應性和抗原性。實驗結果表明，成功構建HhpET-flaB高