海爾曼螺桿菌的流行病學(xué)研究和致病性的活體評(píng)價(jià).pdf

1、背景目的:
　　 海爾曼螺桿菌(Helicobacterheilmannii,Hheilmannii),是除幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,H.pylori)以外的唯一能夠在人胃定植的螺桿菌屬細(xì)菌,被視為胃炎的可能病原體。H.heilmannii感染與胃多種病變相關(guān):急慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃B細(xì)胞粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤,也有引起食管疾病的報(bào)道,其臨床意義值得重視。與國(guó)外相比,我國(guó)有較高的H.heilma

2、nnii感染率(歐美0.25％～0.95％,國(guó)內(nèi)1.78％～7.32％)。隨著H.pylori的發(fā)現(xiàn)獲得諾貝爾獎(jiǎng),H.pylori與慢性胃病的關(guān)系已得到廣泛認(rèn)同,抗菌治療已成為常規(guī)。在大規(guī)模除菌治療多年后的今天,H.heilmannii的流行情況發(fā)生了什么變化卻不得而知。至今為止,H.heilmannii仍不能在體外培養(yǎng)成功,快速診斷還是主要依靠切片染色的形態(tài)學(xué)方法。目前國(guó)外研究大多集中于流行病學(xué)調(diào)查,個(gè)案報(bào)道以及分子鑒定,國(guó)內(nèi)自94年

3、后的研究一直處于空白,H.heilmannii的致病機(jī)制尚不明確,目前世界上尚未建立穩(wěn)定傳代的H.heilmannii菌株。因此,構(gòu)建H.heilmannii能持久定植的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型、建立體外培養(yǎng)的穩(wěn)定方法就顯得尤為重要,成為深入研究的必要手段和必然途徑。
　　 此次研究的目的:了解目前國(guó)內(nèi)H.heilmannii的流行情況；體外培養(yǎng)H.heilmannii；建立H.heilmannii長(zhǎng)期感染小鼠的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型；初步研究其致病

4、機(jī)制。
　　 材料和方法:
　　 1.收集南方醫(yī)院消化科2005-2006年行上消化道電子胃鏡活檢的2339例患者以及1994年1-4月819例患者的臨床資料、內(nèi)鏡資料、病理標(biāo)本。
　　 2.篩檢H.heilmannii感染患者:對(duì)2007年1-6月行上消化道電子內(nèi)鏡檢查的703例胃鏡受檢者行胃粘膜涂片染色,鏡下根據(jù)Hheilmannii典型形態(tài)篩選陽性患者,獲取H.heilmannii感染患者的胃粘膜活檢標(biāo)本并

5、在小鼠體內(nèi)傳代保存。
　　 3.在多種培養(yǎng)基和多種氣體條件以及不同溫度條件下對(duì)成功定植H.heilmannii的鼠胃粘膜組織進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)。
　　 4.建立H.heilmannii長(zhǎng)期感染小鼠模型:4～6周齡健康雄性BALB/c小鼠、雌性C57BL/6小鼠、雄性裸鼠各36只(SPF),分別隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=30)和正常對(duì)照組(n=6)。實(shí)驗(yàn)組灌注H.heilmannii勻漿液0.2ml/只,并于灌胃后第4、8、12

6、、24、36周分別處死6只。正常對(duì)照組分別灌注無菌布氏肉湯0.2ml/只,于實(shí)驗(yàn)第4、12、36周(裸鼠為4、8、12周)分別隨機(jī)處死2只。觀察細(xì)菌定植情況和組織病理變化。
　　 5.半定量RT-PCR檢測(cè)SPF級(jí)Balb/c小鼠、C57BL/6小鼠和裸鼠胃粘膜的IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10mRNA表達(dá)水平差異,初步探索其致病機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.從2339例胃鏡活檢標(biāo)本中檢出7例Hhe

7、ilmannii感染標(biāo)本,總檢出率為0.30％,與國(guó)外同期報(bào)道相符,但低于90年代檢出率0.98％(.p=--0.033)。
　　 2.703例急慢性胃病患者中篩選出1例女性患者,并取其胃粘膜在小鼠體內(nèi)傳代保存,在不同條件下進(jìn)行培養(yǎng)嘗試,目前未獲成功。
　　 3.成功建立了BAI.,B/e小鼠、C57BL/6小鼠、裸鼠月=heilmannii長(zhǎng)期定植的動(dòng)物模型。三種小鼠的定植量隨時(shí)間的延長(zhǎng)都有增加的趨勢(shì),BAI。B/c小

8、鼠有顯著性差異(Mann.WhitneyU秩和檢驗(yàn),P<0.05)。隨著周期延長(zhǎng),BAI。B/c小鼠的慢性炎癥評(píng)分在8周時(shí)最高,隨后下降,而后期再次增高(P=0.042)。而C57BL6小鼠持續(xù)較高,各時(shí)間點(diǎn)沒有顯著差異(P=0.877)。裸鼠未見明顯慢性炎癥,但第4-12周全程維持著明顯的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn),P>0.05)。BALB/c小鼠急性活動(dòng)性炎癥評(píng)分在12周最高,36周最低(Mann-Whime

9、yU秩和檢驗(yàn),P<0.05)；C57BL/6小鼠活動(dòng)性炎癥評(píng)分最低,但8周以后趨于平穩(wěn)(Mann-WhitneyU秩和檢驗(yàn),P>0.05)。第24周后,實(shí)驗(yàn)組免疫健全小鼠開始出現(xiàn)輕度萎縮、腸化和淋巴濾泡的形成,到第36周83％的受染BALB/c小鼠出現(xiàn)淋巴濾泡,明顯破壞粘膜肌層,甚至粘膜全層。對(duì)照組三種小鼠均未見明顯感染和組織學(xué)改變。
　　 4.感染初期,免疫健全小鼠胃粘膜的IFN-γ、IL-1β、IL-4、IL-10mRNA均

10、較對(duì)照組明顯升高(P<0.05),IL-1β在第4周即達(dá)高峰,而IFN-γ、IL-4、IL-10在隨后的第8至12周有最大表達(dá)。免疫健全小鼠的炎癥因子表達(dá)趨勢(shì)相似,但C57BL6小鼠的IFN-γ表達(dá)量在12周后變化不大,而BALB/c小鼠明顯下調(diào),且第36周C57BL6小鼠的IL-4低于對(duì)照組(P<0.05)。裸鼠各細(xì)胞因子也較對(duì)照組稍有增高,除IL-1β、IL-4mRNA外(P<0.05),IFN-γ、IL-10組間相比均無顯著性差異

11、(P>0.05)。BALB/c小鼠的慢性炎癥程度與IL-1β、定植程度分別相關(guān)(rs=0.489,P=0.005；rs=0.446,P=0.012),C57BL/6小鼠慢性胃炎程度與IFN-γ相關(guān)(rs=0.552,P=0.001)。
　　 結(jié)論:
　　 1.現(xiàn)階段H.heilmannii在上消化道疾病中檢出率較90年代降低,大規(guī)模抗生素的使用可能是其因?yàn)椋粰z出病種多見于萎縮性胃炎,提示H.heilmannii是萎縮性胃

12、炎的一種重要致病菌。
　　 2.成功建立了H.heilmanniiBALB/c小鼠和C57BL/6小鼠體內(nèi)長(zhǎng)期定植,為研究H.heilmannii的致病機(jī)制提供了研究模型。
　　 3.T淋巴細(xì)胞代表的細(xì)胞免疫在H.heilmannii感染中占主要地位,體液免疫也起到了一定作用。
　　 4.不同品系小鼠對(duì)H.heilmannii感染的免疫機(jī)制不同,C57BL/6小鼠對(duì)H.heilmannii感染呈Th1型免疫占優(yōu)勢(shì)