禽致病性大腸桿菌耐藥基因和毒力因子的分子流行病學及HPI Irp1細胞表位作用的研究.pdf

1、一、禽致病性大腸桿菌的分離鑒定及血清型分析從江蘇等5省不同地區(qū)送檢的臨床發(fā)病家禽，剖檢可見肝周炎、心包炎、氣囊炎、輸卵管炎及卵黃性腹膜炎等病變，采集病料分離獲得近500株細菌。經(jīng)糖發(fā)酵試驗、尿素酶試驗、IMViC試驗等生化試驗以及三糖鐵培養(yǎng)基培養(yǎng)試驗，證實所獲得的366株細菌為大腸桿菌。用大腸桿菌多因子血清和單因子血清進行血清型鑒定，對其中296株測出了血清型，覆蓋了56種血清型，其中O78，O88，O24，O109，O93，O9，O1

2、1為優(yōu)勢血清型。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)禽源大腸桿菌的血清型變得日益復雜，在種類增加的基礎上，與地區(qū)、宿主等亦有很大相關性：(1)不同地區(qū)來源的菌株優(yōu)勢血清型不同，南通分離株優(yōu)勢血清型為O78，O24，O11，O26，O45，O74；鹽城株為O78，O87；揚州株為O93，O24，O88；常州菌株優(yōu)勢血清型為O78，O109；徐州菌株為O78，O86，O109，O1；泰州菌株為O86，O9。(2)不同家禽來源的菌株，血清型分布有較大差異，雞、鴨、鵝

3、源菌株血清型分別有41種、21種和11種，三者優(yōu)勢血清型不同，雞源菌株為O78、O109、O88、O24，鵝源菌株為O9，O93，O88，O24四種血清型，鴨源大腸桿菌優(yōu)勢血清型為O78，盡管鵝源菌株只有11種血清型，但O114、O118、O123、O141、O23、O73等六種血清型卻只出現(xiàn)于鵝源菌株，O128、O143兩種血清型只出現(xiàn)于鴨源菌株。只有O11、O86、O107三種血清型在三種家禽分離株中均出現(xiàn)，這一現(xiàn)象說明，不同血清型

4、菌株可能存在宿主特異性。 二、禽致病性大腸桿菌分離株耐藥性檢測為了了解臨床用藥對細菌耐藥性的影響，對346株禽致病性大腸桿菌分離菌株用圓紙片法進行了針對氨芐西林/舒巴坦、頭孢噻肟、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、鏈霉素、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、諾氟沙星、復方新諾明、氯霉素、磷霉素、新霉素、利福平、痢特靈、壯觀霉素、多黏菌B、阿奇霉素等19種抗生素的藥物敏感性測定，對藥敏試驗結(jié)果進行統(tǒng)計、分析，結(jié)果表明在所選的19種抗生素中，禽

5、致病性大腸桿菌對常用抗生素的耐藥性已十分嚴重，在測試的藥物中，一些較早使用的抗菌素氨基糖苷類藥物如鏈霉素、慶大霉素，磺胺類藥物如復方新諾明等，對大部分禽致病性大腸桿菌分離株已基本失去抗菌作用，鏈霉素、環(huán)丙沙星等多種藥物的耐藥菌株數(shù)(耐藥率)已超過50％；但APEC分離株對如頭孢噻肟、頭孢曲松，以及磷霉素類藥物等均較為敏感。APEC分離株普遍存在多重耐藥現(xiàn)象，只對1種藥物有耐藥性的菌株只有1株，能耐8種以上受試藥物的菌株有309株，占總受

6、試菌株的89.3％，部分菌株甚至對16種藥物產(chǎn)生了耐藥性。對優(yōu)勢血清型菌株耐藥情況進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明血清型與耐藥性表型之間沒有明顯相關性。實驗結(jié)果提示我們，在禽大腸桿菌病乃至其他細菌病的防治中要合理使用抗菌藥物，盡量減小耐藥性帶來的負面影響。 三、耐藥基因的序列分析及其在禽致病性大腸桿菌中的分子流行病學研究為了了解日益嚴重的APEC耐藥性產(chǎn)生的機制，本研究對耐氨基糖苷類藥物相關基因aadAl、strA、strB、aph(3′

7、)，耐β-內(nèi)酰胺類藥物相關基因oxa-1、oxa-5、oxa-31，耐磺胺類藥物相關基因sulⅡ等進行了PCR擴增。參照Genbank中的相關序列設計引物結(jié)果從細菌基因組中擴增出aadAl、strA、strB、aph(3′)、oxa-1、oxa-5、oxa-31、sulⅡ等耐藥基因，經(jīng)序列分析表明擴增獲得的片段其基因序列與Genbank中參考序列同源性均達到97％以上。對分離保存的200多株禽致病性大腸桿菌進行藥物抗性基因的分子流行病學

8、檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)aadAl、oxa-5陽性率分別為49.1％和30.6％；strA、strB和sulⅡ的陽性率超過了50％，分別為56％、65.7％和56％；aph(3)、oxa-1和oxa-31的陽性率均較低，分別只有16.2％、7.4％和10.6％。多數(shù)菌株攜帶有多種耐藥基因，一個菌株同時攜帶2種以上耐藥基因的有167株，占到了全部測試菌株的77.3％；最多的攜帶了7種被檢測的耐藥基因；大多數(shù)攜帶了3至5種耐藥基因，耐藥基因檢測全陰性

9、的只有20株，占全部被檢菌株不到10％。綜合耐藥基因檢測結(jié)果和耐藥性檢測結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，耐藥基因檢出率的高低基本與相關藥物的耐藥率呈正相關。這為我們了解耐藥性產(chǎn)生的機制以及進一步進行更大范圍的耐藥基因的分子流行病學研究奠定了基礎。 四、菌毛基因fimC和papC在禽致病性大腸桿菌中的流行病學研究菌毛是細菌的一種重要黏附因子，fimC和papC是大腸桿菌Ⅰ型菌毛和P菌毛的主要編碼基因。按菌毛基因fimC和papC參考序列，設計引物用

10、PCR方法分別擴增497bp片段和500bp片段，并對菌株E.coli.NTCHC.05080108擴增的fimC片段和E.coli.DTC.050315-1擴增的papC片段進行克隆和序列測定，結(jié)果顯示與GenBank參考序列比較，同源性高達98％以上。用建立的PCR方法對本室分離鑒定保存的216株禽致病性大腸桿菌(APEC)進行fimC和papC的流行病學調(diào)查，結(jié)果顯示93.5％的分離菌株攜帶有fimC，表明Ⅰ型菌毛在禽致病性大腸桿

11、菌中廣泛存在，而papC僅有14株檢測陽性，占6.5％，其中有13株與Ⅰ型菌毛同時存在。結(jié)果提示我們，對于APEC來說，Ⅰ型菌毛是其重要而且普遍存在的致病因子，而P菌毛在其致病作用中可能起到了輔助加強作用，兩者同時存在于同一菌株中對毒力的影響尚須進一步實驗驗證。 五、耶爾森菌毒力島HPIirp2和fyuA基因在禽致病性大腸桿菌中的流行病學研究按耶爾森菌毒力島HPI結(jié)構基因irp2和fyuA參考序列，設計引物用PCR方法分別擴增4

12、13bp片段和774bp片段，并對E.coli.NTLFC040402等菌株擴增的基因片段進行克隆和序列測定，測序結(jié)果與GenBank參考序列比較，同源性高達98％以上。用建立的PCR方法對本室分離鑒定保存的216株禽致病性大腸桿菌(APEC)進行HPI的流行病學調(diào)查，結(jié)果顯示約44％的分離菌株攜帶有HPI毒力島，表明耶爾森菌毒力島HPI在禽源性大腸桿菌中廣泛存在，與血清型相結(jié)合分析，結(jié)果顯示分離菌株HPI與特定血清型具有相關性，對于O

13、78血清型菌株來說，94.7％的分離菌株都攜帶HPI毒力島，O2、O24、O9和O93分別為66.7％、50％、27.3％和16.7％，而O88和O86都不攜帶該毒力島。 六、自動轉(zhuǎn)運蛋白Vat、Tsh、溶血素E等九種毒力因子在禽致病性大腸桿菌中的流行病學研究采用PCR方法檢測216株禽致病性大腸桿菌(APEC)分離株另外9種毒力相關基因的流行情況。iucD基因的檢出率分別為70.8％，有近一半的檢測菌株擁有iss(58.8％)

14、和tsh(51.4％)基因，所有分離株都不含有eaeA基因。結(jié)合前兩章試驗結(jié)果可見，在所檢測的216株APEC中，只有4株分離菌不含有任何所檢測的毒力相關基因，19株分離菌只攜帶1種所檢測的毒力相關基因，多數(shù)菌株擁有2種以上毒力基因，其中有5株待測菌擁有10種毒力相關基因。實驗結(jié)果分析顯示，hlyE基因主要在O78菌株中出現(xiàn)；35個分離株共同擁有fimC+iucD+irp2+fyuA+iss+colV+tsh+基因組合模式，其中18株O

15、78血清型菌株擁有該毒力基因組合模式。這些實驗數(shù)據(jù)必將為今后更好地研究APEC的分類、揭示APEC的致病機理，進而提出有效的防治措施提供重要的參考依據(jù)。 七、HPI-Irp1細胞表位作用初探通過生物軟件DNAStar的分析，篩選出irp1和fyuA基因上10個表位作用優(yōu)勢較強的區(qū)域。設計特異性引物10對，進行PCR擴增，將獲得的PCR產(chǎn)物，插入原核表達載體pET32a，構建重組質(zhì)粒；將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入菌毛陰性宿主菌BL21