RNAi介導(dǎo)沉默IGF-IR抑制胃癌細(xì)胞BGC823生長及侵襲轉(zhuǎn)移的體外研究.pdf

1、第一章IGF-IR在人胃癌中的表達(dá)及臨床意義 目的：探討IGF-IR在人胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義。 方法：采用RT-PCR和Western blot.方法檢測50例手術(shù)切除胃癌、癌旁及手術(shù)切緣非癌組織中IGF-IRmRNA和蛋白的表達(dá)。采用免疫組化的方法檢測113例手術(shù)切除胃癌組織及30例胃鏡下活檢非癌胃粘膜上皮組織中IGF-IR的表達(dá)。結(jié)合胃癌患者臨床病理特征和術(shù)后生存隨訪資料分析臨床意義。 結(jié)果：在50例新

2、鮮標(biāo)本中，92.0％(46/50)的胃癌組織，62.0％(31/50)的癌旁組織以及56.0％(28/50)的非癌組織中可檢測到IGF-IR mRNA的表達(dá)。胃癌組織中IGF-IR mRNA的平均表達(dá)水平明顯高于癌旁及非癌組織(2.25±0.43 vs.2.02±0.16 & 1.93±0.46，P<0.05)。而IGF-IRmRNA在癌旁組織中的表達(dá)略高于非癌組織無顯著性差異(P=0.34)。Western blot結(jié)果顯示：在86.

3、0％(43/50)的胃癌組織中，60.0％(30/50)的癌旁組織和58.0％(29/50)的非癌組織中可以檢測到IGF-IR蛋白的表達(dá)，GC中IGF-IR蛋白的陽性表達(dá)率顯著高于PC和NC(P<0.01)。半定量分析IGF-IR蛋白在胃癌組織中的平均表達(dá)水平明顯高于癌旁和非癌組織(1.86±0.30 vs.1.72±0.24 & 1.14±0.10，P<0.01)；而其在癌旁組織中的表達(dá)也較非癌組織中高(P<0.01)。IGF-IR

4、mRNA和蛋白的表達(dá)水平與胃壁浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床病理分期(TNM分期)密切相關(guān)(P<0.05)。免疫組化檢測顯示：IGF-IR蛋白染色定位與細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，在非癌胃粘膜上皮細(xì)胞中IGF-IR蛋白陽性表達(dá)率為66.7％(20/30)且多為弱陽性染色，而在胃癌細(xì)胞內(nèi)陽性表達(dá)率為72.6％(82/113)呈現(xiàn)粗大的棕色的強(qiáng)陽性染色，IGF-IR蛋白在胃癌細(xì)胞的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。IGF-IR蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與患者性

5、別、年齡、癌灶原發(fā)部位、幽門螺桿菌感染與否以及有無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)；與胃壁浸潤深度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胃癌細(xì)胞的組織分化程度有關(guān)(P<0.05)，IGF-IR在Ⅲ+Ⅳ期患者胃癌細(xì)胞中表達(dá)明顯強(qiáng)于Ⅰ+Ⅱ期(P<0.05)。生存率分析顯示，113例胃癌患者手術(shù)后平均生存時(shí)間為44.6月，中位生存時(shí)間為39.0月。組間比較IGF-IR高表達(dá)組胃癌患者手術(shù)后生存率明顯降低(P<0.05)。 結(jié)論：1.IGF-IR在胃癌組織中表

6、達(dá)上調(diào)，與在非胃癌組織中的表達(dá)存在顯著性差異，IGF-IR表達(dá)與癌細(xì)胞分化程度、區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目、胃壁浸潤深度及患者臨床病理分期密切相關(guān)；提示IGF-IR可能參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展；2.IGF-IR蛋白過量表達(dá)與胃癌患者預(yù)后不良密切相關(guān)，IGF-IR可能成為反映胃癌預(yù)后的一個(gè)新的腫瘤標(biāo)志物。 第二章靶向IGF-IR的逆轉(zhuǎn)錄病毒siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 目的：構(gòu)建靶向IGF-IR的siRNA表達(dá)載體，并進(jìn)一步研究其對人胃癌

7、細(xì)胞BGC823的IGF-IR表達(dá)的抑制效應(yīng)。 方法：利用逆轉(zhuǎn)錄pSUPER/H1質(zhì)粒構(gòu)建IGF-IR特異性siRNA表達(dá)載體和對照組表達(dá)載體，并用PCR電泳及基因測序予以鑒定。IGF-IR特異性siRNA表達(dá)載體以脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC823，48小時(shí)后用RT-PCR，Westernblot法分別檢測IGF-IRmRNA和蛋白的表達(dá)水平。 結(jié)果：成功構(gòu)建靶向IGF-IR的siRNA表達(dá)載體和對照組表達(dá)載體，分別命名

8、為pSUPER-IGF-IR-siRNAl，pSUPER-IGF-IR-siRNA2和pSUPER-Control-siRNA。pSUPER-IGF-IR-siRNAl和pSUPER-IGF-IR-siRNA2轉(zhuǎn)染組IGF-IRmRNA和IGF-IR蛋白的表達(dá)量明顯低于pSUPER-Control-siRNA轉(zhuǎn)染組及PBS處理的陰性對照組(P<0.05)。 結(jié)論：利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體成功構(gòu)建了有效沉默胃癌細(xì)胞IGF-IR目的基因的

9、siRNA質(zhì)粒。 第三章 IGF-IR干擾對胃癌BGC823細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的：研究RNAi介導(dǎo)IGF-IR基因沉默對胃癌細(xì)胞BGC823增殖、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。 方法：用靶向IGF-IR的siRNA質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞0h、 24h、48h、72h，用MTT法檢測BGC823細(xì)胞的增殖活性。IGF-IR特異性siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞48h，并用流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化，同時(shí)應(yīng)

10、用PI染色、DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測細(xì)胞凋亡；用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)評價(jià)BGC823侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化。 結(jié)果：IGF-IR特異性siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞后24h，細(xì)胞增殖無明顯變化，48h、72h活細(xì)胞數(shù)明顯減少，且抑制率分別為62.15±0.98％和59.82±0.68％明顯增高(P<0.05)，但48h和72h組間比較無顯著性差異(P>0.05)。分析細(xì)胞周期變化在第48小時(shí)，G0/G1期，S期和G2/M期的細(xì)

11、胞百分比分別為59.42±4.01％，37.83±2.13％和3.71±0.18％，較pSUPER-Control-siRNA與PBS處理的陰性對照組G1期細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中pSUPER-IGF-IR-siRNA2轉(zhuǎn)染組穿過人工膜的細(xì)胞數(shù)量顯著少于pSUPER-Control-siRNA及PBS陰性對照組(98.33±1 1.37 vs.128.33±5.69 &135.33±7.77) (p<0.05)。劃

12、痕愈合實(shí)驗(yàn)中，劃痕后12h開始愈合距離出現(xiàn)明顯差異，劃痕后36小時(shí)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示，pSUPER-IGF-IR-siRNA2轉(zhuǎn)染組細(xì)胞顯著少于pSUPER-Control-siRNA組及PBS陰性對照組為(58.00±1 1.00 vs.1 16.67±12.10&122.67±11.15) (P<0.05)。劃痕后36h，pSUPER-Control-siRNA組及PBS陰性對照組劃痕已基本愈合，而pSUPER-IGF-IR-siRNA2

13、轉(zhuǎn)染組只愈合了約40％。 結(jié)論： 1.IGF-IR在胃癌細(xì)胞BGC823的高表達(dá)可能在抑制胃癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖中起重要作用；2.IGF-IR沉默表達(dá)可顯著抑制BGC823細(xì)胞侵襲運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)移潛能，IGF-IR可能在調(diào)控胃癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移過程中其關(guān)鍵性作用。 第四章基于免疫共沉淀.免疫印跡.質(zhì)譜技術(shù)鑒定胃癌中IGF-IR作用分子的研究 目的：探討IGF-IR蛋白相互作用的功能蛋白，研究IGF-IR在胃癌細(xì)胞中

14、的調(diào)控作用機(jī)制。 方法：利用免疫共沉淀和質(zhì)譜分析技術(shù)相結(jié)合，先采用免疫共沉淀技術(shù)從胃癌BGC823細(xì)胞中富集IGF-IR結(jié)合蛋白，再采用SDS-PAGE電泳技術(shù)對含IGF-IR結(jié)合蛋白的復(fù)合物進(jìn)行分離，染色，切取差異蛋白條帶，經(jīng)脫色、還原、烷基化、原位酶解、樣品萃取、脫鹽及點(diǎn)樣，然后采用ESI-MS/MS分析，分析結(jié)果peaklist文件輸入Mascot查詢系統(tǒng)進(jìn)行檢索查詢。 結(jié)果：獲得包括sorcin蛋白在內(nèi)的24個(gè)蛋