RNAi抑制NRP2表達(dá)對胃癌細(xì)胞SGC7901生長及侵襲轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，死亡率在世界范圍惡性腫瘤中占第二位。我國是胃癌高發(fā)國家，胃癌位居所有惡性腫瘤死亡第一位。胃癌臨床表現(xiàn)為進(jìn)展快、預(yù)后差，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是降低胃癌死亡率的關(guān)鍵手段。遺憾的是絕大多數(shù)患者就診時(shí)已是進(jìn)展期，早期胃癌所占比例不足10％。研究發(fā)現(xiàn)2～4％的粘膜內(nèi)胃癌、10～15％的粘膜下胃癌、80％的進(jìn)展期胃癌有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，胃癌的預(yù)后與癌組織浸潤深度及是否發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。目前研究認(rèn)為，腫瘤相關(guān)淋巴管

2、的形成能夠促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，所以現(xiàn)在有很多研究聚焦于如何抑制腫瘤環(huán)境下淋巴管的形成。VEGFR3是第一個(gè)被驗(yàn)證的淋巴管生成的特異性標(biāo)記物，VEGFR3是淋巴管內(nèi)皮生長刺激因子VEGFC的特異性受體。VEGFC與其受體VEGFR3結(jié)合后可引起淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮促進(jìn)淋巴管新生的作用。
　　 神經(jīng)纖毛蛋白（Neuropilins，NRPs）是一種跨膜糖蛋白，最初是作為軸突導(dǎo)向分子Semaphorin

3、的受體而發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中起著重要調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步研究證明NRPs在腫瘤的生長轉(zhuǎn)移中也起著關(guān)鍵的作用。NRPs家族包括NRPI和NRP2兩個(gè)成員。Maresa Caunt等最新研究認(rèn)為NRP2參與了VEGFC誘導(dǎo)的淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和淋巴管新生（特別是腫瘤相關(guān)的新生功能性淋巴管）功能，在腫瘤動(dòng)物模型中阻斷NRP2功能發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移至哨兵淋巴結(jié)和遠(yuǎn)隔器官減少的現(xiàn)象。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是胃癌的一個(gè)重要的生物學(xué)特性，胃癌經(jīng)淋巴道發(fā)生局部和遠(yuǎn)處

4、轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后差的重要因素之一，NRP2是否參與胃癌發(fā)生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制如何是本課題需驗(yàn)證的設(shè)想。
　　 目的：檢測不同胃癌細(xì)胞株中NRP2的表達(dá)，通過體外實(shí)驗(yàn)和裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)了解我們構(gòu)建的RNA干擾表達(dá)載體能否特異性的干擾胃癌細(xì)胞中NRP2基因并影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)特性及移植瘤中淋巴管的生成。
　　 方法：
　　 1.采用RT-PCR、Western blot方法在mRNA和蛋白水平檢測NRP2在胃癌

5、細(xì)胞株BGC823、SGC7901的表達(dá)。
　　 2.利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)合成含有針對NRP2基因特定序列的寡核苷酸片段，并將其定向克隆入真核表達(dá)載體，得到重組質(zhì)粒shRNA-NRP2-1、shRNA-NRP2-2、shRNA-NRP2-3和陰性對照質(zhì)粒shRNA-HK。
　　 3.用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞株SGC7901，應(yīng)用半定量RT-PCR、Western blot法檢測轉(zhuǎn)染前后NRP2mRNA和蛋白表達(dá)的情

6、況，篩選出最佳干擾質(zhì)粒。
　　 4.采用流式細(xì)胞儀、侵襲小室實(shí)驗(yàn)等檢測shRNA2-2轉(zhuǎn)染前后SGC7901細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、凋亡、侵襲、遷移能力，并用半定量RT-PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后SGC7901細(xì)胞CXCR4的表達(dá)。
　　 5.裸鼠皮下接種胃癌細(xì)胞SGC7901成瘤，分為干擾組、陰性對照組及空白對照組三組，成瘤后三組裸鼠分別皮下注射shRNA-NRP2-2、shRNA-HK、PBS，不同時(shí)間點(diǎn)測定腫瘤體積和裸鼠

7、體重的差異，連續(xù)觀察6周，腫瘤組織切片免疫組化檢測NRP2蛋白變化及計(jì)數(shù)淋巴管的密度（MLD），評價(jià)體內(nèi)環(huán)境中NRP2RNAi表達(dá)載體對腫瘤細(xì)胞及淋巴管生成的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.兩株細(xì)胞均有NRP2表達(dá)，BGC823、SGC7901細(xì)胞中NRP2蛋白的相對含量分別是0.63±0.02、0.85±0.03，兩者差別有顯著性（P<0.05。BGC823、SGC7901細(xì)胞中NRP2mRNA的相對含量是0.56±0

8、.01、0.86±0.03，兩者差別有顯著性（P<0.05）。SGC7901細(xì)胞中NRP2表達(dá)水平更高。
　　 2.經(jīng)酶切和測序分析證明成功構(gòu)建了NRP2小分子RNA干擾表達(dá)載體。
　　 3.重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SGC7901細(xì)胞后，經(jīng)Western blot檢測，NRP2/β-actin吸光度比值：質(zhì)粒NRP2-1、NRP2-2、NRP2-3分別為0.68±0.01、0.34±0.03、0.58±0.01，HK組和空白組分別為

9、0.89±0.02和0.91±0.03。三組質(zhì)粒對NRP2蛋白表達(dá)的抑制率分別為31.5％、63.2％和49.6％；經(jīng)RT-PCR檢測，NRP2/β-actin吸光度比值：質(zhì)粒NRP2-1、NRP2-2、NRP2-3分別為0.63±0.02、0.51±0.02、0.61±0.01；HK組為0.95±0.01，空白組為0.97±0.01。三組質(zhì)粒對NRP2mRNA的抑制率分別為36.3％、57.4％和37.2％。質(zhì)粒NRP2-2抑制NRP

10、2表達(dá)的效應(yīng)最佳，與質(zhì)粒NRP2-1和NRP2-3相比，有顯著性差異（P<0.05）。
　　 4.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn)表明，與HK陰性對照組和空白對照組相比，NRP2干擾組G0/G1期細(xì)胞百分比顯著升高，S期細(xì)胞減少，細(xì)胞凋亡率增加；Transwell小室侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)表明NRP2干擾組細(xì)胞侵襲和遷移能力明顯低于HK陰性對照組和空白對照組；NRP2干擾組CXCR4mRNA表達(dá)明顯低于HK陰性對照組和空白對照組。

11、>　　 5.與HK陰性對照組和空白對照組相比，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中Western blot與免疫組化檢測NRP2干擾組NRP2蛋白表達(dá)明顯降低，與體外實(shí)驗(yàn)一致，裸鼠移植瘤的體積、重量及微淋巴管密度在NRP2干擾組也明顯受抑制。
　　 結(jié)論：
　　 1.NRP2特異性RMA干擾敲低SGC7901細(xì)胞NRP2表達(dá)后，可抑制細(xì)胞體外增殖、侵襲、遷移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　 2.裸鼠皮下胃腺癌移植瘤模型應(yīng)用shRNA2-2處理