shRNA介導(dǎo)IGF-IR基因沉默抑制鼠心肌肥厚的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　評價磁性納米顆粒作為基因載體介導(dǎo)小發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shRNA)靶向沉默IGF1R對去甲腎上腺素誘導(dǎo)的鼠心肌肥厚的抑制作用及其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　檢索IGF-1R的基因序列，依照此序列構(gòu)建同時表達(dá)綠色熒光蛋白基因(GFP)和特異性針對小鼠心肌細(xì)胞胰島素樣生長因子-1受體(IGF-1R)基因的shRNA的質(zhì)粒pGFPshIGF-1R，共設(shè)計(jì)了兩條序列，用聚合物作為載體，將質(zhì)粒pGFPshlGF-1R轉(zhuǎn)

2、染進(jìn)鼠心肌細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)染效率較高的基因序列;根據(jù)上述篩選的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的鼠心肌細(xì)胞，同時與單純的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法相比較，通過western blot檢測兩種轉(zhuǎn)染方法對平滑肌細(xì)胞中IGF-1R蛋白表達(dá)下調(diào)情況;外加磁場作用，篩選轉(zhuǎn)染效率最高的磁場參數(shù)。在去甲腎上腺素誘導(dǎo)的鼠心肌肥厚細(xì)胞及動物模型中，通過心重/體重比、心肌橫截面積、心超檢測左室大小及心功能等評價心肌肥厚模型建立情況。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGFPshlGF-1R與聚合物的復(fù)合物，分子

3、水平用westernblot檢測聚合物載體體內(nèi)轉(zhuǎn)染24h、48h、72h后，組織中IGF-1R蛋白表達(dá)受抑情況;注射結(jié)束后1周，再次通過心重/體重比、心肌橫截面積、心超檢測左室大小及心功能等評價聚合物質(zhì)粒pGFPshlGF-1R體內(nèi)抑制心肌肥厚程度，并探索IGF1R下游信號通路蛋白活化情況。
　　結(jié)果:
　　首先通過測序驗(yàn)證了RNA干擾序列成功插入質(zhì)粒內(nèi)，經(jīng)過western blot和RT-PCR檢測IGF1R表達(dá)，篩選出序

4、列2為抑制效率較高的序列，對心肌肌細(xì)胞IGF-1R在mRNA水平和蛋白水平的抑制率分別達(dá)到47％±1.8％，和41％±1.2％。在轉(zhuǎn)染載體篩選方面，不論脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染還是應(yīng)用聚合物轉(zhuǎn)染方式，都可以將質(zhì)粒pGFPshlGF-1R轉(zhuǎn)染進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)。相對于空白對照組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，聚合物作為載體展現(xiàn)了較高的效率。流式細(xì)胞結(jié)果表明，綠色熒光蛋白基因(GFP)陽性的細(xì)胞數(shù)占35.1±3.1％，而在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組綠色熒光蛋白基因(GFP)陽性的細(xì)胞數(shù)只有1

5、3.0±5.1％;協(xié)同磁場轉(zhuǎn)染，在250mT輻照15min的條件下轉(zhuǎn)染效率最高，可以達(dá)到58％左右。在心肌肥厚模型的構(gòu)建上，通過去甲腎上腺素成功誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和小鼠心臟肥厚的模型，并檢測出IGF1R明顯增高、ANP及β-MHC的mRNA表達(dá)也明顯增高。在體內(nèi)轉(zhuǎn)染條件的實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)尾靜脈注射表達(dá)IGF1R shRNA的聚合物，能有效到達(dá)心肌組織，轉(zhuǎn)染24h、48h、72h均能明顯抑制IGF1R表達(dá)，顯著減少去甲腎上腺素誘導(dǎo)的心肌肥厚，改善心功