VEGF基因沉默抑制磨損顆粒介導(dǎo)的炎癥性骨溶解的實驗研究.pdf

1、目的：(1)建立研究磨損顆粒誘導(dǎo)炎癥性骨溶解的理想動物模型。(2)探討應(yīng)用RNA干擾技術(shù)在體外和體內(nèi)環(huán)境下抑制VEGF基因表達(dá)的可行性。(3)探討在小鼠植骨氣囊模型中局部應(yīng)用靶向VEGF基因的慢病毒對顆粒誘導(dǎo)的炎癥性骨溶解反應(yīng)的影響。
　　 方法：(1)設(shè)計4條靶向小鼠VEGF基因的miRNA序列，構(gòu)建miRNA表達(dá)載體，然后將載體轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞，通過Realtime RT-PCR檢測VEGF基因的表達(dá)變化，篩選出最高效的干擾序

2、列。(2)使用篩選出的最高效的miRNA序列構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體，進(jìn)行重組慢病毒的包裝生產(chǎn)及滴度的測定。(3)將構(gòu)建好的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7，觀察在體外環(huán)境下慢病毒對VEGF基因表達(dá)的影響。(4)構(gòu)建小鼠的植骨氣囊模型，按照對照組，錯配miRNA組(MS組)，VEGF miRNA治療組(VEGF)組，通過局部氣囊注射慢病毒液進(jìn)行生物學(xué)干預(yù)，10天后處死小鼠取材，進(jìn)行組織學(xué)和分子生物學(xué)分析。顱骨-氣囊組織的HE染色觀察炎

3、性反應(yīng)的程度和骨破壞的情況；從mRNA水平和蛋白水平檢測顱骨-囊壁組織中VEGF基因的表達(dá)變化；檢測TNF-α、IL-1β和RANKL的mRNA水平。
　　 結(jié)果：(1)成功構(gòu)建了靶向小鼠VEGF基因的miRNA表達(dá)載體，篩選出5’-ACGAGATAGAGTACATCTTCA-3’為最高效序列。(2)成功構(gòu)建了攜帶最高效miRNA序列的重組慢病毒。(3)靶向小鼠VEGF基因的重組慢病毒在體外條件下有效抑制了VEGF基因的表達(dá)，干

4、擾效率達(dá)到78％。(4)成功構(gòu)建了小鼠植骨氣囊模型，HE染色顯示VEGF組較對照組氣囊囊壁厚度顯著降低(P<0.05)，炎癥細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P<0.05)，骨破壞程度減輕。VEGF組中顱骨-氣囊組織VEGF基因的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)較對照組顯著降低(P<0.05)，TNF-α、IL-1β和RANKL的mRNA水平表達(dá)也顯著降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論：(1)小鼠植骨氣囊模型是研究磨損顆粒誘導(dǎo)炎癥性骨溶解反應(yīng)的理想模