HU-308對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 磨損顆粒誘導(dǎo)的假體周?chē)侨芙馐侨斯りP(guān)節(jié)無(wú)菌性松動(dòng)的主要因?yàn)椤７乐喂侨芙獾暮诵脑谟诨謴?fù)假體周?chē)橇?而骨量的維持取決于骨改建過(guò)程,涉及破骨細(xì)胞骨與成骨細(xì)胞骨數(shù)量與功能的調(diào)控。既往的研究顯示HU-308影響骨代謝,對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解的防治具有潛在的研究及應(yīng)用價(jià)值。本課題通過(guò)對(duì)HU-308在體外對(duì)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞作用及體內(nèi)對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)的骨溶解中骨改建過(guò)程作用的研究,探討其對(duì)防治骨溶解的作用及機(jī)理；并初步探討四環(huán)素

2、類(lèi)標(biāo)記物對(duì)骨改建過(guò)程的潛在影響。
　　 方法：
　　 1.取健康自愿者的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,分別檢測(cè)其在成骨誘導(dǎo)中不同時(shí)間段大麻素類(lèi)CB2受體的表達(dá)狀況,同時(shí)檢測(cè)不同濃度的HU-308對(duì)成骨細(xì)胞活性標(biāo)志物堿性磷酸酶表達(dá)及鈣化結(jié)節(jié)形成的影響；
　　 2.購(gòu)買(mǎi)已分離純化后的新鮮健康正常人濃縮白細(xì)胞,分離提取單個(gè)核細(xì)胞,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化生成。檢測(cè)CB2受體及破骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因在誘導(dǎo)分化中的不同階段的破骨細(xì)胞上的表達(dá)狀況；

3、免疫熒光化學(xué)染色法檢測(cè)CB2受體在破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞上的表達(dá)；檢測(cè)不同濃度的HU-308對(duì)破骨細(xì)胞生成及吸收功能的作用；
　　 3.利用流式細(xì)胞技術(shù)Annexin V-PI染色法檢測(cè)不同濃度HU-308對(duì)破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞凋亡的影響；Western blotting技術(shù)檢測(cè)HU-308作用下凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2、Bak、p53和Activated caspase-3的合成狀況；
　　 4.用UHMWPE顆粒誘導(dǎo)的小

4、鼠顱骨溶解模型,給予HU-308干預(yù),通過(guò)對(duì)骨溶解區(qū)域的骨生成和骨吸收參數(shù)分析,檢測(cè)HU-308體內(nèi)對(duì)磨損顆粒誘導(dǎo)骨溶解過(guò)程的影響；
　　 5.取健康自愿者的外周血,提取單個(gè)核細(xì)胞,檢測(cè)不同濃度的脫氧土霉素、鹽酸四環(huán)素、茜素紅S和鈣黃綠素對(duì)破骨細(xì)胞生成及骨吸收功能的影響,以及對(duì)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞凋亡的影響；Wistar大鼠分別于實(shí)驗(yàn)的第1天和第7天注射上述熒光標(biāo)志物對(duì)新生骨進(jìn)行雙標(biāo)記,應(yīng)用Van Gilson和TRAP染色,評(píng)估其

5、對(duì)骨改建參數(shù)(包括骨礦沉積率、標(biāo)化礦化表面積、骨形成率、平均破骨細(xì)胞數(shù)、破骨細(xì)胞面積、TRAP活力、骨膠原保存率等)的影響；
　　 結(jié)果：
　　 1.CB2受體mRNA進(jìn)行性表達(dá)在成骨誘導(dǎo)中的成骨細(xì)胞上。在成骨誘導(dǎo)第7天時(shí)未發(fā)現(xiàn)表達(dá),在第10天的成骨細(xì)胞中開(kāi)始表達(dá),21天明顯表達(dá)。HU-308不影響成骨細(xì)胞ALP的表達(dá),但促進(jìn)成骨細(xì)胞鈣化結(jié)節(jié)的生成,并存在量效關(guān)系；
　　 2.CB2受體m RNA表達(dá)在人破骨細(xì)胞

6、及其前體細(xì)胞上。HU-308抑制破骨細(xì)胞生成及骨吸收功能,并存在量效關(guān)系；
　　 3.HU-308促進(jìn)凋亡蛋白Bcl-2、p53和Activated caspase-3蛋白的合成,而對(duì)Bak蛋白合成無(wú)影響,從而誘導(dǎo)破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞凋亡；
　　 4.HU-308體內(nèi)增加新骨生成量、顱骨厚度和顱骨標(biāo)記熒光厚度,但對(duì)顱骨長(zhǎng)度無(wú)影響,抑制骨吸收面積和破骨細(xì)胞生成；
　　 5.土霉素和四環(huán)素體外劑量依賴性的誘導(dǎo)破骨細(xì)胞

7、前體細(xì)胞凋亡,體內(nèi)及體外抑制破骨細(xì)胞生成和骨吸收,而對(duì)骨生成參數(shù)無(wú)影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.HU-308體外通過(guò)CB2受體劑量依賴性促進(jìn)成骨細(xì)胞增生；
　　 2.HU-308體外通過(guò)CB2受體劑量依賴性的抑制破骨細(xì)胞生成及吸收功能；
　　 3.HU-308體外通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞及其前體細(xì)胞多種凋亡蛋白的合成,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡；
　　 4.HU-308體內(nèi)抑制破骨細(xì)胞吸收并且同時(shí)促進(jìn)骨生成,對(duì)骨