白介素10通過巨噬細胞極化作用減輕磨損顆粒誘導的炎癥和骨溶解.pdf

1、本文分為兩個部分進行探討：
　　第一部分 IL-10極化巨噬細胞的體外研究
　　目的：
　　體外研究觀察IL-10極化在磨損顆粒刺激骨髓來源的巨噬細胞中的作用:
　　1.確定IL-10極化巨噬細胞的理想用量。
　　2.觀察IL-10對磨損顆粒刺激的骨髓來源的巨噬細胞的基因表達的影響。
　　3.觀察IL-10對磨損顆粒刺激的骨髓來源的巨噬細胞的蛋白表達的影響。
　　材料和方法：
　　1.將R

2、AW264.7細胞種入六孔板中（2×105個/孔），4-6小時后細胞貼壁，加入IL-10進行刺激，細胞分為三組:不加IL-10（對照組）;加入10μg IL-10;加入20μg IL-10。加入IL-10進行刺激后48小時收集細胞提取蛋白。Western blot方法檢測STAT3和磷酸化STAT3的表達。
　　2.原代骨髓起源的巨噬細胞的分離與培養(yǎng)
　　CO2氣體法處死Sprague Dawley大鼠，75％酒精中浸泡3次

3、，每次10分鐘。分離大鼠股骨和脛骨，用注射器和DMEM完全型培養(yǎng)基將骨髓細胞沖入50ml無菌離心管中，用細胞過濾器過濾細胞并離心，接著加入4攝氏度預冷的紅細胞裂解液裂解30分鐘，裂解紅細胞完成后，用1×PBS清洗細胞2次，用70％DMEM完全培養(yǎng)基和30％L929細胞培養(yǎng)上清重懸細胞進行培養(yǎng)。過夜后將未貼壁的細胞丟棄。
　　3.將骨髓起源的巨噬細胞種入12孔盤中（5×105個/孔），待細胞貼壁后，將其分為三組:第一組不加任何刺激（

4、陰性對照組）;第二組加入2mg PMMA顆粒（陽性對照組）;第三組加入2mg PMMA顆粒和20ng IL-10（處理組）。細胞刺激5天后收集細胞提取總RNA進行基因表達檢測。RT-PCR法檢測IL-1β、CD80、MHCⅡ、CD163、IL-10、TGF-β1和CCR2基因表達的變化。
　　4.將5×103個細胞種入8孔chamber slide里，待細胞貼壁后，將細胞隨機分為三組:第一組不加任何刺激（陰性對照組）;第二組加入2

5、mg PMMA顆粒（陽性對照組）;第三組加入2mg PMMA顆粒和20ngIL-10(處理組)。刺激一周后進行細胞免疫化學染色，檢測iNOS和CD163的表達情況。
　　結果：
　　1.Western blot法檢測RAW264.7細胞經(jīng)過不同濃度IL-10刺激后總的STAT3和磷酸化的STAT3表達情況。從實驗結果看，經(jīng)過IL-10刺激的RAW264.7表達總的STAT3沒有變化，但是磷酸化的STAT3的表達隨著IL-10

6、濃度的增加表達逐漸增強。
　　2.實時定量RT-PCR方法檢測經(jīng)過PMMA顆?；騊MMA顆粒與IL-10共同刺激的骨髓起源的巨噬細胞中IL-1β、CD80、MHCⅡ、CD163、IL-10、TGF-β1和CCR2基因表達的變化。實驗數(shù)據(jù)表明PMMA顆粒刺激組能夠誘導骨髓起源的巨噬細胞IL-1β、CD80和MHCⅡ的基因表達。經(jīng)過IL-10處理的組能夠減少PMMA顆粒刺激骨髓起源的巨噬細胞中IL-1β的基因表達(p＜0.01)。而其

7、他的M1標記物:CD80、MHCⅡ的基因表達沒有明顯的變化。同時，IL-10處理組能明顯的增加骨髓起源的巨噬細胞中CD163、IL-10、TGF-β1和CCR2的基因表達(p＜0.01)。
　　3.細胞免疫組織化學染色用于檢測特異性M1標記物iNOS和M2標記物CD163的表達。細胞免疫組織化學染色顯示PMMA顆粒能夠顯著誘導iNOS的表達(p＜0.001)。IL-10處理組能明顯抑制PMMA顆粒誘導iNOS表達的作用。IL-10

8、處理組還可以明顯促進骨髓起源的巨噬細胞表達CD163(p＜0.001)。
　　結論：
　　1.20ng IL-10是理想的實驗研究用量。
　　2.IL-10可以促進M2型巨噬細胞的基因表達。
　　3.IL-10能夠促進PMMA顆粒刺激的骨髓來源的巨噬細胞分化為M2型巨噬細胞并且減少PMMA顆粒刺激的骨髓來源的巨噬細胞的分化為M1巨噬細胞。
　　第二部分 IL-10通過極化巨噬細胞減輕磨損顆粒誘導的骨溶解

9、r>　　目的：
　　1.建立模仿假體松動的air pouch動物模型。
　　2.觀察IL-10能否改善磨損顆粒引起的骨溶解。
　　3.探討IL-10減輕磨損顆粒引起的骨溶解的具體機制。
　　材料和方法：
　　1.建立實驗動物模型
　　剔除Balb/c小鼠背部毛發(fā)露出背部部分，用碘伏消毒背部皮膚，用5毫升注射器皮下注射3毫升過濾過的無菌空氣在皮下形成一個空氣囊泡。每隔一天向空氣囊泡中注射一次空氣以維持空

10、氣囊泡形態(tài)。6天后，通過手術方法從供體小鼠得到一部分股骨（約0.5厘米）或一部分頭蓋骨（約0.6厘米×0.3厘米）并手術置入空氣囊泡中。24小時后，所有小鼠分為三組（每組8只）:第一組只注射200μl PBS(陰性對照組);第二組注射200μlUHMWPE顆粒（2毫克）（陽性對照組）;第三組注射200μl UHMWPE顆粒并且20ngIL-10溶解其中（處理組）。IL-10或PBS每隔一天補注射一次。
　　2.Micro CT掃描

11、
　　在手術置入股骨或頭蓋骨24后和處死小鼠之前分別進行Micro CT掃描。掃描參數(shù)設置為:30μm isotropic voxel size;400 projections;200 ms exposure time;70 kW voltage and114μA current。用Micro CT分析軟件進行三維圖像的重建和骨密度分析。用骨體積與總體積的比值分析總的骨質(zhì)丟失情況。
　　3.組織病理學檢測
　　從第一次

12、注射IL-10開始開始記錄，七天后處死所有實驗小鼠，收集股骨或頭蓋骨及其周圍完整的炎性反應膜。一部分炎性膜凍存于負80攝氏度低溫冰箱中用于實時定量RT-PCR和western blot分析STAT1、NF-κ3p65、JNK1、STAT3、SHIP、STAT6和PPAR-γ的基因或蛋白表達水平。頭蓋骨和炎性反應膜包埋于冰凍切片包埋液中凍存于負80攝氏度低溫冰箱，制備冰凍切片，用于檢測TRAP陽性細胞的數(shù)量。股骨和炎性反應膜用10％的福爾

13、馬林固定液固定，用10％EDTA溶液脫鈣一周后制備石蠟切片。H&E染色用于觀察不同組別之間的炎性反應膜的厚度以及細胞的浸潤情況。免疫組織化學染色用于檢測iNOS或CD163的表達情況。
　　結果：
　　1.炎性反應膜的特征
　　UHMWPE顆粒誘發(fā)了明顯的局部炎癥，導致與陰性對照組相比，其他兩組炎性反應膜的厚度和細胞浸潤數(shù)量的明顯增加。陰性對照組的炎性反應膜的平均厚度為125.8±5.58μm，而陽性對照組的炎性反應膜

14、的平均厚度為449.81±10.59μm(p＜0.001)。同時細胞計數(shù)顯示細胞浸潤數(shù)量從4749±144個細胞/平方毫米（陰性對照組）增加到6564±144個細胞/平方毫米（陽性對照組）(p＜0.001)。盡管在所有UHMWPE顆粒處理組中巨噬細胞的比例與陰性對照組相比明顯增加，但是，IL-10處理組的細胞浸潤數(shù)量明顯減少（5674±139個細胞/平方毫米，p＜0.001）。
　　2.IL-10在M2型巨噬細胞極化和骨溶解中的作

15、用
　　包裹有股骨的炎性反應膜的組織學評估表明與陰性對照組相比其他兩組炎性反應膜中iNOS陽性巨噬細胞和CD163陽性巨噬細胞明顯增多(p＜0.01)。然而與只有UHMWPE顆粒處理的陽性對照組相比IL-10處理組減弱了iNOS蛋白的表達(p＜0.05)，另一方面IL-10處理組明顯增強了CD163蛋白的表達(p＜0.05)。
　　TRAP染色表明IL-10處理組的切片中TRAP陽性細胞的數(shù)量明顯減少，而只有UHMWPE顆粒

16、處理的切片表現(xiàn)為很強的TRAP活性(p＜0.001)。Micro CT掃描顯示IL-10能夠明顯的減輕UHMWPE顆粒誘導的骨溶解，骨密度(BMD)分析表明IL-10處理組的骨密度明顯高于只有UHMWPE處理的陽性對照組(p＜0.001)，同時，骨體積與總體積的比值分析表明IL-10處理組的骨體積比例更高(p＜0.001)。
　　3.實時定量RT-PCR檢測STAT1、NF-κBp65、JNK1、STAT3、SHIP、STAT6和

17、PPAR-γ的基因表達
　　數(shù)據(jù)顯示經(jīng)過IL-10處理后不僅抑制了STAT1(p＜0.05)、NF-κBp65(p＜0.05)和JNK1(p＜0.01)的基因表達，而且誘導了STAT3(p＜0.05)的基因表達。然而，STAT6、SHIP和PPAR-γ的基因表達沒有明顯的差異。
　　4.Western blot檢測信號通路蛋白
　　IL-10處理組的樣品與只有UHMWPE顆粒處理組樣品相比表現(xiàn)為低表達磷酸化的STAT1