DHA聯(lián)合去甲斑蝥素抑制人胃癌細(xì)胞BGC-823增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的:
　　研究DHA聯(lián)合去甲斑蝥素體外抗胃癌細(xì)胞作用。
　　方法:
　　1實驗分組:根據(jù)預(yù)實驗和文獻報導(dǎo)用RPMI1640培養(yǎng)基配置4組DHA，終濃度分別為(10、20、30、50 mg/mL)，空白組為等體積培養(yǎng)基，對照組為不加處理的細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)基配置4組用DMSO溶解后的去甲斑蝥素，終濃度為(5、10、20、40μg/mL)，得出各藥的半對數(shù)抑制濃度(IC50)值，選用均低于單藥IC50值的DHA

2、(30mg/mL)聯(lián)合去甲斑蝥素（5μg/mL），對照組加入含無水乙醇(＜0.5％，V/V)和DMSO(＜1％，V/V)。
　　2 NADH酶組織化學(xué)染色:將1×105個BGC-823細(xì)胞接種于含蓋玻片的6孔板中，使其爬行呈單層貼壁且處于對數(shù)生長期，加藥繼續(xù)培養(yǎng)24 h，取出蓋玻片，冰0.1 mol/L PBS溶液沖洗2遍，NADH酶染液孵育液置37℃水浴箱45 min，樹膠封片顯微鏡觀察。
　　3吖啶橙染色:將1×105個

3、BGC-823細(xì)胞接種于含蓋玻片的6孔板中，使其爬行呈單層貼壁且處于對數(shù)生長期，加藥24 h后取出蓋玻片，冰0.1mol/L PBS溶液沖洗2遍，95％乙醇溶液固定5min，滴加0.01％吖啶橙染液染色1min，熒光顯微鏡觀察并拍照保存。
　　4 MTT實驗:將培養(yǎng)瓶中處于貼壁生長細(xì)胞用0.25％胰蛋白酶混合0.02％EDTA消化，然后利用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，用1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個/mL，分裝到96孔平底型培養(yǎng)板，

4、每孔加液量100μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞呈單層貼壁且處于對數(shù)生長期。根據(jù)實驗分組設(shè)計加藥，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，終止反應(yīng)時每孔加濃度為2 mg/mL的MTT10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加二甲基亞砜150μL，酶標(biāo)儀振蕩器搖振10 min以使甲瓚產(chǎn)物充分溶解。在波長490 nm條件下嚴(yán)格測定A值。其中細(xì)胞抑制率計算公式為:（實驗組A值/對照組A值）×100％。
　　5流式細(xì)胞檢測:細(xì)胞樣品制備:收集24 h實驗組細(xì)胞1×1

5、05個/mL，以冰0.01％PBS洗滌細(xì)胞2次，重懸于700 mL/L預(yù)冷乙醇固定，PI一步法染色，流式細(xì)胞儀檢測亞二倍體峰的比例并擬合細(xì)胞周期曲線;PI雙標(biāo)記法檢測bcl-2凋亡蛋白，蛋白含量以平均熒光強度表示，平均熒光強度=[lg(X-Mode)]×340。
　　結(jié)果:
　　1 NADH酶組織化學(xué)染色
　　對照組細(xì)胞呈正常伸展?fàn)顟B(tài)，染色顆粒均勻，胞核規(guī)則圓形，位于細(xì)胞中央，核膜清楚。經(jīng)DHA聯(lián)合NCTD治療后，可見

6、細(xì)胞裂解，胞核分裂、胞膜邊界清的凋亡小體，細(xì)胞體積縮小，形態(tài)不一，胞質(zhì)顆粒深染，密度增加。核膜核仁破碎，結(jié)構(gòu)更加緊密，細(xì)胞核固縮呈均一的顆粒物。
　　2吖啶橙染色
　　對照組細(xì)胞呈現(xiàn)典型的腫瘤細(xì)胞特征，細(xì)胞大小不等，細(xì)胞核呈規(guī)則的圓形，位于細(xì)胞中央。經(jīng)DHA聯(lián)合NCTD治療后，可見細(xì)胞胞體腫脹，胞核變形，呈腎形、馬蹄形（凋亡小體形成和核破碎）。
　　3 DHA和NCTD對人胃癌BGC-823細(xì)胞抑制率的影響
　　

7、用MTT法分別測定DHA4個濃度(10、20、30、50 mg/mL)和NCTD4個濃度(5、10、20、40μg/mL)對BGC-823細(xì)胞作用24 h后的抑制率。DHA和NCTD均抑制細(xì)胞生長，得出DHA和NCTD的IC50值分別為45.37 mg/mL和7.85μg/mL，聯(lián)合用藥組細(xì)胞生長抑制率較單藥明顯升高，作用效果以公式:聯(lián)合指數(shù)(CI)=AB％/A％×B％計算，(CI=1表示相加，小于1表示協(xié)同，大于1表示拮抗)。選用均低

8、于單藥IC50值的DHA(30 mg/mL)聯(lián)合NCTD(5 ug/mL)對細(xì)胞抑制率的CI為0.187±0.052(P＜0.01)，說明聯(lián)合用藥的效果是協(xié)同作用。
　　4流式細(xì)胞檢測
　　DHA、NCTD以及DHA聯(lián)合NCTD處理細(xì)胞后在G0/G1期出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰，分別為5.3％、6.1％、14.1％，同時3組的細(xì)胞凋亡率均高于對照組的細(xì)胞凋亡率(3.4％)。擬合細(xì)胞周期曲線，對照組、DHA和NCTD的G0/G1