Cdc6參與腫瘤細(xì)胞干性及去甲斑蝥素誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞凋亡.pdf

1、腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cell，CSC)是指腫瘤組織中的一群具有無限自我更新能力的細(xì)胞，是促使腫瘤無限生長的來源。CSC能夠抵抗放化療的殺傷，是腫瘤復(fù)發(fā)的蓄庫和轉(zhuǎn)移的根源。如何有效抑制或清除CSC成為了當(dāng)今腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，而誘導(dǎo)并維持CSC多潛能“干性”的分子機(jī)制是CSC研究的核心問題。
　　Cdc6(cell division cycle6)主要功能為起始DNA復(fù)制，在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)且與腫瘤惡性進(jìn)程相關(guān)，而C

2、dc6的高表達(dá)不僅僅是腫瘤旺盛增殖所導(dǎo)致的結(jié)果，Cdc6本身就有促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的能力。最近研究發(fā)現(xiàn)，Cdc6在腫瘤細(xì)胞中可作為轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制抑癌基因INK4/ARF的轉(zhuǎn)錄，INK4/ARF能同時(shí)編碼3個(gè)蛋白:p16INK4A、p15INK4B和p14ARF，分別通過pRb和p53通路調(diào)控細(xì)胞周期。INK4/ARF在人類腫瘤中出現(xiàn)頻發(fā)的失活，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。而且此基因轉(zhuǎn)錄抑制是CSC多潛能“干性”的重要特征，因此Cd

3、c6極有可能通過抑制INK4/ARF參與CSC多潛能“干性”。
　　去甲斑蝥素(Norcantharidin)是我國自主研發(fā)的抗腫瘤藥物，目前被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的治療，但其具體的抗腫瘤機(jī)制目前仍未完全闡明，本課題組之前研究發(fā)現(xiàn)NCTD能降解腫瘤細(xì)胞Cdc6蛋白，發(fā)揮抗腫瘤活性。
　　目的:
　　1、通過有限稀釋法從建系腫瘤細(xì)胞株中篩選獲得CSC，并鑒定。
　　2、探究在CSC中，Cdc6蛋白表達(dá)情況及其是否參與

4、調(diào)控INK4/ARF基因。
　　3、探究去甲斑蝥素（抑制Cdc6）對(duì)CSC的影響。
　　方法:
　　1、CSC篩選:取建系的腫瘤細(xì)胞HepG2和UMUC-3，超低吸附培養(yǎng)板中進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，加入無血清培養(yǎng)基（含EGF20ng/mL、b-FGF20ng/mL、LIF20ng/mL、干細(xì)胞添加劑B2720μL/mL和BSA4μg/mL的DMEM/F12培養(yǎng)基），連續(xù)培養(yǎng)2個(gè)月以上獲得。
　　2、CSC鑒定:利用qPC

5、R、流式細(xì)胞術(shù)，檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD133、CD44、NANOG、OCT4、ABCG2;裸鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞成瘤能力。
　　3、CSC功能學(xué)方面檢測:MTS實(shí)驗(yàn)檢測體外細(xì)胞增殖及化療藥物的殺傷、EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測DNA復(fù)制、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。
　　4、通過Western blotting和Chromatin binding檢測Cdc6蛋白總量及染色質(zhì)中和非染色質(zhì)部分的表達(dá)。
　　5、通過Chromatin

6、 Immunoprecipitation(ChIP)檢測Cdc6與INK4/ARF基因調(diào)控區(qū)域的相互作用。
　　6、通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。
　　結(jié)果:
　　1、HepG2和UMUC-3經(jīng)有限稀釋法培養(yǎng)5天可見成球生長的單克隆細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)20天后取單克隆細(xì)胞團(tuán)繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)至60天。
　　2、CSC鑒定:流式細(xì)胞結(jié)果顯示，篩選60天的HepG2細(xì)胞CD133+比例高達(dá)90.4±1.1％，顯著高于母代腫瘤細(xì)胞

7、（0.5±0.2％），CD44+比例為0.5±0.12％也高于母代腫瘤細(xì)胞（0.1±0.04％）。qPCR結(jié)果顯示CD133、CD44、NANOG、OCT4、ABCG2的mRNA含量均顯著高于母代腫瘤細(xì)胞。體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)顯示，接種篩選后的HepG2細(xì)胞（1×105個(gè)/只）成瘤率為1/5，5×106個(gè)/只的成瘤率為3/5，而相對(duì)應(yīng)的母代HepG2均未成瘤。這些結(jié)果表明通過本方法篩選出的細(xì)胞即為CSC。
　　3、CSC對(duì)紫杉醇耐藥(PT

8、X)。MTS結(jié)果顯示:PTX對(duì)HepG2-CSC和UMUC-3-CSC的IC50均＞＞500nM/ml，遠(yuǎn)大于其對(duì)母代HepG2（60.9±5.7）、UMUC-3(63.0±4.8)。
　　4、CSC為靜止休眠期細(xì)胞。流式細(xì)胞細(xì)胞周期檢測顯示CSC的G0/G1期比例顯著提高（HepG2-CSC:70.72±5.2％，UMUC-3-CSC:70.24±4.9）;EdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示CSC幾乎無DNA復(fù)制，表明CSC大多處于靜止期。血清

9、釋放后靜止的CSC重新進(jìn)入增殖周期，且血清釋放四天后，CSC的增殖速率顯著高于母代腫瘤細(xì)胞。
　　4、靜止休眠期CSC中Cdc6的表達(dá)。Chromatin binding顯示，靜止期CSC的Cdc6仍有相當(dāng)數(shù)量的表達(dá)，且大多結(jié)合于染色質(zhì)上，與相對(duì)應(yīng)的母代腫瘤細(xì)胞相比，非染色質(zhì)部分的含量顯著降低。血清釋放進(jìn)入增殖周期后，非染色質(zhì)結(jié)合的Cdc6逐漸增多，至24小時(shí)后恢復(fù)到與母代腫瘤細(xì)胞相似的水平。
　　5、通過ChIP顯示，在C

10、SC中，Cdc6結(jié)合在INK4/ARF基因調(diào)控區(qū)（RDINK4/ARF）(-311～-157)區(qū)域，而在-175～-51區(qū)域沒有結(jié)合。
　　6、CSC加入NCTD培養(yǎng)后，HepG2-CSC和UMUC-3-CSC凋亡比例（70.54±0.26％，29.93±1.32％）顯著高于對(duì)照組（35.00±0.89％，15.11±0.78％）。
　　結(jié)論:
　　1、通過有限稀釋法能有效地從建系腫瘤細(xì)胞株中篩選獲得處于靜止休眠期的C