去細(xì)胞化技術(shù)建立全肝臟生物支架的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝臟是人體最大、最重要的腺器官，幾乎參與體內(nèi)的一切新陳代謝活動(dòng)，是物質(zhì)代謝的中樞；肝臟也是人體重要的屏障器官，其解毒和吞噬功能與免疫密切相關(guān)。 近二十年來(lái)，肝病對(duì)人類的危害日益增加。我國(guó)是世界上病毒性肝炎和肝癌的高發(fā)國(guó)家。我國(guó)乙型肝炎表面抗原攜帶者約占整個(gè)人口的10%，全球每年死于肝癌的病人百余萬(wàn)，我國(guó)約占總數(shù)的一半。各種原因引起的急性肝功衰竭，其死亡率達(dá)60～80%。而到目前為止，對(duì)于終末期肝病根本的治療方法只有器官移植，其它

2、的方法如透析、人工肝支持系統(tǒng)等雖然能延長(zhǎng)病人的生命，但是不能替代肝臟的所有功能，很難防止病情惡化。目前，由于供體的短缺，許多需要器官移植的病人仍然只能在等待移植的名單上。并且肝臟移植需要數(shù)年的抗免疫治療，會(huì)導(dǎo)致對(duì)肝臟和腎臟的長(zhǎng)期損害，擴(kuò)展的醫(yī)療護(hù)理和住院時(shí)間也增加了治療的費(fèi)用。肝組織工程，作為緩解供體短缺的一個(gè)步驟，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 組織工程面臨許多共同的問(wèn)題如支架的選擇、種子細(xì)胞的選擇、免疫排斥等。其中支架材料是組織工程研

3、究的重點(diǎn)之一，支架材料應(yīng)有足夠的表面積用于細(xì)胞粘附，也應(yīng)有足夠的空間使細(xì)胞集落擴(kuò)展，增殖，足夠的孔隙以利于物質(zhì)與氣體的交換，具有可降解性，良好的生物相容性。肝臟組織工程的以往的研究很多集中于微載體粘附培養(yǎng)、球形體聚集培養(yǎng)、微囊培養(yǎng)、中空纖維培養(yǎng)、可降解生物支架培養(yǎng)等。但是研究證明將貼附有肝細(xì)胞的微載體植入體內(nèi)后肝細(xì)胞的代謝活性迅速降低。研究者認(rèn)為主要是由于肝細(xì)胞具有復(fù)雜的代謝合成功能，使通過(guò)單純擴(kuò)散方式供給營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與氧氣的普通培養(yǎng)方法很

4、難為肝細(xì)胞及時(shí)有效的提供營(yíng)養(yǎng)及氧氣供應(yīng)，目前解決該問(wèn)題的研究主要集中在兩個(gè)方向：一、構(gòu)建具有管道結(jié)構(gòu)的模擬肝臟三維結(jié)構(gòu)的支架；二、采用灌注培養(yǎng)的模式。常見(jiàn)的肝臟血管的模擬方法包括1、利用制造技術(shù)進(jìn)行三維打印肝管道樣結(jié)構(gòu)的生物支架；2、在支架材料上結(jié)合可以誘導(dǎo)血管形成的血管生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)毛細(xì)血管的形成，并可以對(duì)血管的密度進(jìn)行控制，附合膠原有利于細(xì)胞的粘附。國(guó)外采用RFB反應(yīng)器進(jìn)行循環(huán)灌注式培養(yǎng)模式進(jìn)行肝細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)出肝組織樣結(jié)構(gòu)，肝臟功能

5、也可以維持較長(zhǎng)時(shí)間。但總的來(lái)說(shuō)在支架模擬肝臟的內(nèi)在結(jié)構(gòu)以提供充足氧氣與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供養(yǎng)從而維持肝細(xì)胞的功能方面仍然不能達(dá)到臨床上功能替代的要求。 去細(xì)胞化技術(shù)是組織工程支架材料研究的一門新技術(shù)，該技術(shù)將細(xì)胞破壞為碎片并將該碎片白細(xì)胞外基質(zhì)上移除，而細(xì)胞外基質(zhì)成分被保留。去細(xì)胞化的目標(biāo)是移除所有的細(xì)胞及細(xì)胞核，同時(shí)將對(duì)保留細(xì)胞外基質(zhì)的組成成分的生化結(jié)構(gòu)、生物學(xué)活性及機(jī)械完整性的影響降低到最低限度。常用獲得去細(xì)胞的方法主要包括物理、化

6、學(xué)、酶學(xué)的方法。物理方法主要包括快速凍融、攪拌、超聲波；化學(xué)方法主要為運(yùn)用酸性、堿性溶液、去污劑（曲拉通X-100，十二烷基磺酸鈉，熊去氧膽酸）等化學(xué)溶劑及利用高滲與低滲溶液；酶學(xué)的方法常利用胰蛋白酶與核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶。為了達(dá)到完全去細(xì)胞化的技術(shù)，常根據(jù)不同器官聯(lián)合應(yīng)用不同的方法。細(xì)胞外基質(zhì)由于其在細(xì)胞的生長(zhǎng)、繁殖、遷移、分化、發(fā)育等生物學(xué)行為方面起到重要作用而受到生物學(xué)家的重視，同時(shí)由于細(xì)胞外基質(zhì)成分在不同的物種之間具有高度保守

7、性，所以去細(xì)胞化技術(shù)得到的細(xì)胞外基質(zhì)支架具有良好的生物相容性及低免疫原性。由于具有以上優(yōu)點(diǎn)，細(xì)胞外基質(zhì)成分在組織工程的支架制備中成為常用的材料。去細(xì)胞化技術(shù)在心血管、輸尿管、膀胱等細(xì)胞外基質(zhì)含量豐富的組織器官的組織工程的研究中已經(jīng)得到應(yīng)用，并在實(shí)驗(yàn)與臨床研究中證明其具有良好的生物相容性，低免疫原性。但是該研究對(duì)于肝臟、腎臟等細(xì)胞含量豐富的器官的研究較少。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)合以前關(guān)于血管、心臟瓣膜、輸尿管、膀胱等組織器官去細(xì)胞化的方法，并

8、結(jié)合肝臟本身的特點(diǎn)，探索全肝臟去細(xì)胞化的方法，得到了保留肝臟基本管道與細(xì)胞外基質(zhì)成分的肝臟生物支架。并進(jìn)行生物支架的相容性研究，該支架在模擬肝臟的管道結(jié)構(gòu)方面具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，符合目前對(duì)肝臟支架的要求，可以作為肝臟組織工程的備選支架之一。 目的：研究利用去細(xì)胞技術(shù)獲取全肝生物支架的方法，并對(duì)得到的全肝生物支架保留的成分及結(jié)構(gòu)進(jìn)行組織學(xué)觀察，以及對(duì)其進(jìn)行生物相容性驗(yàn)證，為進(jìn)一步的肝臟組織重建奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：取SD大鼠

9、肝臟，將所得肝臟經(jīng)門靜脈插管后依次灌注曲拉通X100（TritonX100），十二烷基磺酸鈉（SDS），用時(shí)約8小時(shí)，并用0.01mM的磷酸鹽緩沖液（PBS）灌洗支架上殘留SDS210h，將支架中殘留SDS的濃度降低至0.01%，將所得的標(biāo)本放入-800C冰箱30分鐘快速冰凍，取出后在-20℃的條件下行病理切片，切片后行蘇木素-伊紅染色（H&E染色）。管道鑄型：將肝上下腔靜脈、及肝下下腔靜脈以1#絲線結(jié)扎，并以19G套管針行膽道插管，插

10、管后分別注入鑄型劑（鑄型劑的成分過(guò)氯乙烯塑料作為溶質(zhì)、丙酮為溶劑配成8%～10%填充劑含油畫(huà)顏料，紅色為門靜脈，綠色為膽道）行膽道與門靜脈鑄型，觀察門靜脈與膽道結(jié)構(gòu)的完整性；細(xì)胞外基質(zhì)成分染色：將所得標(biāo)本多部位隨機(jī)取材后多聚甲醛脫水，石蠟包埋后切片，行Masson's三色染色觀察有無(wú)膠原纖維保留，地衣紅染色觀察彈力纖維的保留情況，銀染觀察有無(wú)網(wǎng)狀纖維存在，電子顯微鏡觀察：將所得標(biāo)本放入2.5%的戊二醛中固定，4°冰箱保存，送南方醫(yī)科大學(xué)

11、電子顯微鏡觀察室行觀察保留組織的超微結(jié)構(gòu)及有無(wú)細(xì)胞殘存，生物相容性觀察：將標(biāo)本行冰凍切片，切片厚度為50um，切片放入六孔培養(yǎng)板中，切片行Co60照射滅菌，所得切片與原代肝細(xì)胞、C3A細(xì)胞懸浮共培養(yǎng)，觀察該材料的生物相容性.原代肝細(xì)胞的獲取方法參照slegen的膠原酶兩步灌注法。 結(jié)果：經(jīng)該方法灌注大鼠肝臟50個(gè)，成功35個(gè)，成功率70%，失敗的原因主要為灌注過(guò)程中出現(xiàn)管道扭轉(zhuǎn)、空氣阻塞、插管過(guò)深及凝血等原因?qū)е赂闻K灌注不夠完全

12、，主要表現(xiàn)為肝臟周邊有區(qū)域灌注不全、個(gè)別分葉無(wú)反應(yīng)。利用去垢劑進(jìn)行肝臟去細(xì)胞化的方法是有效的，但整個(gè)過(guò)程需注意保持血管通暢。1、灌注前后的肝臟相比，灌注后所得肝臟生物支架大體觀透明，包膜完整，保留了肝臟的形態(tài)，肉眼可見(jiàn)包膜內(nèi)的Glisson系統(tǒng)保存。2、管道鑄型結(jié)果：管道鑄型結(jié)果可見(jiàn)膽道與門靜脈伴行保留，呈樹(shù)形結(jié)構(gòu)，無(wú)鑄型液外溢，管道結(jié)構(gòu)保持完整。3、組織學(xué)鑒定結(jié)果：各項(xiàng)組織染色結(jié)果未見(jiàn)明顯肝細(xì)胞殘留，未見(jiàn)到肝臟原有的小葉樣結(jié)構(gòu)存在，但

13、是可以看到纖維圍成的管道樣結(jié)構(gòu)，見(jiàn)大量膠原纖維染色、彈力纖維染色，未見(jiàn)明顯網(wǎng)狀纖維染色，掃描電子顯微鏡結(jié)果未見(jiàn)明顯細(xì)胞存在，可見(jiàn)大量纖維樣結(jié)構(gòu)編織成網(wǎng)狀，并見(jiàn)管道樣結(jié)構(gòu)，4、生物相容性鑒定結(jié)果：支架與細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果示C3A細(xì)胞與切片后的肝臟支架共培養(yǎng)21天可以見(jiàn)到細(xì)胞粘附在懸浮于培養(yǎng)基中的切片支架上呈串珠樣生長(zhǎng)，與普通平板相對(duì)比在形態(tài)無(wú)明顯差異，但生長(zhǎng)時(shí)間明顯延長(zhǎng)，證明該支架具有良好的生物相容性。 結(jié)論：經(jīng)門靜脈插管灌注去垢劑是