脫細胞脊髓支架制備及其生物相容性的實驗研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在應用脫細胞技術，在徹底去除細胞的前提下，盡量保持細胞外基質(zhì)的完整性，最大限度的保持其天然三維空間立體結(jié)構(gòu)，成功制備出脫細胞脊髓支架，采用制備好的脫細胞脊髓支架與大鼠脊髓神經(jīng)元細胞進行共培養(yǎng)，觀察細胞在支架材料上的生長情況，為今后進行脫細胞脊髓支架移植治療脊髓損傷提供了依據(jù)。
　　方法：
　　1.取SPF級Wistar雌性大鼠10只，采用化學萃取法制備脫細胞脊髓支架。采用HE染色、髓鞘染色、掃描電鏡

2、觀察脫細胞脊髓表面結(jié)構(gòu)，將大鼠脊髓支架組織 DNA提取，并進行 DNA含量分析以明確大鼠脊髓支架是否成功脫掉細胞成分。
　　2.取實驗用幼年SD鼠2只，麻醉后取出脊髓組織并剪碎，置入裝有細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)采用酶消化法對細胞進行分離純化。細胞在體外增殖，傳代后，對其用 NSE免疫組化染色進行鑒定，并觀察生長狀況，繪制生長曲線。傳至第2代后，將神經(jīng)元細胞收集并與脫細胞脊髓支架共培養(yǎng)24小時， MTT觀察細胞存活情況。
　　

3、3.將脫細胞脊髓支架消毒后修整為0.5cm的小段，取第三代大鼠脊髓神經(jīng)元細胞共基培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況，利用HE染色觀察神經(jīng)元脫細胞脊髓支架結(jié)合生長情況，利用NSE、NEUN染色鑒定共培養(yǎng)細胞是否為神經(jīng)元細胞，利用掃描電鏡觀察整體空間三維結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：
　　1.采用化學萃取法制備的大鼠脫細胞脊髓支架，Wistar大鼠脫細胞脊髓支架呈乳白色，半透明狀，扁圓柱形，直徑和長度均略微變短，質(zhì)地柔軟，韌性增大，無異味。

4、HE染色、髓鞘染色顯示大鼠脫細胞脊髓支架橫切面上呈現(xiàn)大小不等的網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，細胞成分基本完全去除，未見細胞核藍色顆粒和紅色細胞質(zhì)存在，軸突和髓鞘均已去除，網(wǎng)孔壁由均質(zhì)粉紅染色的細胞外基質(zhì)構(gòu)成，網(wǎng)孔內(nèi)外均未見細胞殘留，髓鞘掃描電子顯微鏡顯示大鼠脫細胞脊髓支架呈不規(guī)則網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，細胞外基質(zhì)呈層狀排列，形成不規(guī)則圓形空腔，具備優(yōu)秀的三維立體網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，孔壁較薄，表面積較大，孔洞間相互連通，經(jīng) DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測后未見 DNA條帶，大鼠脫細

5、胞脊髓支架脫細胞完全，不含脫氧核糖核酸類物質(zhì)，細胞已完全除去。
　　2.制備的大鼠脊髓神經(jīng)元細胞免疫組化 NSE抗體染色結(jié)果顯示細胞胞體呈棕褐色，細胞核呈藍紫色，該細胞呈典型的神經(jīng)元細胞形態(tài)，即所制備的細胞為大鼠脊髓神經(jīng)原細胞。
　　3.大鼠脊髓神經(jīng)元細胞與大鼠脫細胞脊髓支架共培養(yǎng)后HE染色結(jié)果顯示大鼠脊髓神經(jīng)元細胞粘附于大鼠脫細胞脊髓支架生長，細胞生長狀態(tài)良好。掃描電鏡顯示大鼠脊髓神經(jīng)元細胞在三維通道中充分生長，形成聚集的

6、細胞區(qū)域，不影響大鼠脫細胞脊髓支架空間結(jié)構(gòu)，NEUN染色及 NSE顯示神經(jīng)元細胞軸突生長狀態(tài)良好，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，說明大鼠脫細胞脊髓支架與大鼠脊髓神經(jīng)元細胞具備良好的生物相容性與適應性。
　　結(jié)論：
　　1.采用化學萃取法制備的大鼠脫細胞脊髓支架在徹底去除細胞的前提下，盡量保持細胞外基質(zhì)的完整性，最大限度的保持其天然三維空間立體結(jié)構(gòu)。
　　2.將大鼠脊髓神經(jīng)元細胞與大鼠脫細胞脊髓支架共培養(yǎng)，大鼠脊髓神經(jīng)元細胞細胞生長狀態(tài)