脫細(xì)胞脊髓支架制備及其生物相容性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　本研究旨在應(yīng)用脫細(xì)胞技術(shù)，在徹底去除細(xì)胞的前提下，盡量保持細(xì)胞外基質(zhì)的完整性，最大限度的保持其天然三維空間立體結(jié)構(gòu)，成功制備出脫細(xì)胞脊髓支架，采用制備好的脫細(xì)胞脊髓支架與大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞在支架材料上的生長情況，為今后進(jìn)行脫細(xì)胞脊髓支架移植治療脊髓損傷提供了依據(jù)。
　　方法：
　　1.取SPF級(jí)Wistar雌性大鼠10只，采用化學(xué)萃取法制備脫細(xì)胞脊髓支架。采用HE染色、髓鞘染色、掃描電鏡

2、觀察脫細(xì)胞脊髓表面結(jié)構(gòu)，將大鼠脊髓支架組織 DNA提取，并進(jìn)行 DNA含量分析以明確大鼠脊髓支架是否成功脫掉細(xì)胞成分。
　　2.取實(shí)驗(yàn)用幼年SD鼠2只，麻醉后取出脊髓組織并剪碎，置入裝有細(xì)胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)采用酶消化法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分離純化。細(xì)胞在體外增殖，傳代后，對(duì)其用 NSE免疫組化染色進(jìn)行鑒定，并觀察生長狀況，繪制生長曲線。傳至第2代后，將神經(jīng)元細(xì)胞收集并與脫細(xì)胞脊髓支架共培養(yǎng)24小時(shí)， MTT觀察細(xì)胞存活情況。
　　

3、3.將脫細(xì)胞脊髓支架消毒后修整為0.5cm的小段，取第三代大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞共基培養(yǎng)。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，利用HE染色觀察神經(jīng)元脫細(xì)胞脊髓支架結(jié)合生長情況，利用NSE、NEUN染色鑒定共培養(yǎng)細(xì)胞是否為神經(jīng)元細(xì)胞，利用掃描電鏡觀察整體空間三維結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：
　　1.采用化學(xué)萃取法制備的大鼠脫細(xì)胞脊髓支架，Wistar大鼠脫細(xì)胞脊髓支架呈乳白色，半透明狀，扁圓柱形，直徑和長度均略微變短，質(zhì)地柔軟，韌性增大，無異味。

4、HE染色、髓鞘染色顯示大鼠脫細(xì)胞脊髓支架橫切面上呈現(xiàn)大小不等的網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞成分基本完全去除，未見細(xì)胞核藍(lán)色顆粒和紅色細(xì)胞質(zhì)存在，軸突和髓鞘均已去除，網(wǎng)孔壁由均質(zhì)粉紅染色的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，網(wǎng)孔內(nèi)外均未見細(xì)胞殘留，髓鞘掃描電子顯微鏡顯示大鼠脫細(xì)胞脊髓支架呈不規(guī)則網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞外基質(zhì)呈層狀排列，形成不規(guī)則圓形空腔，具備優(yōu)秀的三維立體網(wǎng)孔狀結(jié)構(gòu)，孔壁較薄，表面積較大，孔洞間相互連通，經(jīng) DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后未見 DNA條帶，大鼠脫細(xì)

5、胞脊髓支架脫細(xì)胞完全，不含脫氧核糖核酸類物質(zhì)，細(xì)胞已完全除去。
　　2.制備的大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞免疫組化 NSE抗體染色結(jié)果顯示細(xì)胞胞體呈棕褐色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色，該細(xì)胞呈典型的神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)，即所制備的細(xì)胞為大鼠脊髓神經(jīng)原細(xì)胞。
　　3.大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞與大鼠脫細(xì)胞脊髓支架共培養(yǎng)后HE染色結(jié)果顯示大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞粘附于大鼠脫細(xì)胞脊髓支架生長，細(xì)胞生長狀態(tài)良好。掃描電鏡顯示大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞在三維通道中充分生長，形成聚集的

6、細(xì)胞區(qū)域，不影響大鼠脫細(xì)胞脊髓支架空間結(jié)構(gòu)，NEUN染色及 NSE顯示神經(jīng)元細(xì)胞軸突生長狀態(tài)良好，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，說明大鼠脫細(xì)胞脊髓支架與大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞具備良好的生物相容性與適應(yīng)性。
　　結(jié)論：
　　1.采用化學(xué)萃取法制備的大鼠脫細(xì)胞脊髓支架在徹底去除細(xì)胞的前提下，盡量保持細(xì)胞外基質(zhì)的完整性，最大限度的保持其天然三維空間立體結(jié)構(gòu)。
　　2.將大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞與大鼠脫細(xì)胞脊髓支架共培養(yǎng)，大鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞生長狀態(tài)