小鼠成體肝臟祖細(xì)胞(AHPC)體外培養(yǎng)模型的建立和生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的：
　　 研究正常成體小鼠肝細(xì)胞的增殖能力和分化潛能,分離正常成體小鼠肝臟內(nèi)可能存在的干細(xì)胞或祖細(xì)胞并建立體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型,研究其基本的生物學(xué)特性。
　　 方法：
　　 應(yīng)用改良的Seglen二步法灌注和離心分離肝臟細(xì)胞,將肝細(xì)胞初步分為肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞(parenchymalhepatocytes,PH)部分和富含AHPC(adulthepaticprogenitorcells,AHPC)部分,對兩部分的細(xì)胞

2、用添加胎牛血清(FBS)的改良DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),持續(xù)觀察超過60天,分析兩部分中肝細(xì)胞的形態(tài)學(xué)差異,以及通過細(xì)胞增殖和克隆的形成情況分析兩部分中肝細(xì)胞增殖能力的差異。應(yīng)用免疫熒光技術(shù)對具有高增殖能力細(xì)胞及其形成的克隆進(jìn)行Albumin、AFP、CK19、c-kit、CD45、CD34、Oct-4、Desmin、CD16、Thy-1和nestin等染色,分析細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)和克隆內(nèi)細(xì)胞的成熟分化情況。利用形態(tài)學(xué)觀察、記錄細(xì)胞增殖狀況

3、,以及免疫熒光染色技術(shù)初步分析肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(nonparenchymalcell,NPC)的生長對于AHPC活化、增殖和分化的影響。另外,嘗試了AHPC克隆的傳代培養(yǎng)。
　　 結(jié)果：
　　 本研究中兩部分肝細(xì)胞均獲得較高的產(chǎn)量和活性(＞90％),完全滿足實(shí)驗(yàn)的需要。PH部分和富含AHPC部分的肝細(xì)胞大小分別為(37.03±6.65)μm和(22.63±2.04)μm,存在明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05),但在大小分布比

4、例上存在小部分的重疊。兩部分的貼壁細(xì)胞中均含有NPC污染,其中富含AHPC部分較多,占貼壁細(xì)胞總數(shù)的70.3％,NPC增殖后肝細(xì)胞活化并開始增殖,所有的肝細(xì)胞克隆均表達(dá)肝星狀細(xì)胞標(biāo)記物Desmin。富含AHPC部分的肝細(xì)胞增殖能力明顯較PH部分高,兩部分的克隆形成率分別為21.45％±1.25％和0.28％±0.09％(p＜0.001)。富含AHPC部分中,約13.5％的貼壁肝細(xì)胞在接種后第2～3天活化并迅速增殖,第4～5天形成小的細(xì)胞

5、克隆,極少數(shù)細(xì)胞(0.5％～1％)在接種后第3天即可形成克隆;培養(yǎng)30天后克隆內(nèi)出現(xiàn)類似成熟的肝細(xì)胞,細(xì)胞克隆可持續(xù)擴(kuò)增超過60天,最大克隆面積達(dá)到0.64mm2,細(xì)胞平均增殖超過10個周期。貼壁后24小時,所有的肝細(xì)胞均強(qiáng)陽性表達(dá)肝細(xì)胞標(biāo)記物Albumin,不表達(dá)AFP和CK19,培養(yǎng)第5天細(xì)胞克隆開始表達(dá)Albumin和AFP,第30天克隆內(nèi)部分細(xì)胞表達(dá)膽管細(xì)胞標(biāo)記物CK19,同時發(fā)現(xiàn)Albumin陰性細(xì)胞。通過免疫熒光雙染發(fā)現(xiàn),培

6、養(yǎng)第30天,AHPC克隆內(nèi)同時存在Albumin陽性和AFP陽性、Albumin陽性和AFP陰性、Albumin陽性和CK19陰性、CK19陽性和AFP陰性、CK19陽性和AFP陽性的細(xì)胞。另外,AHPC可以傳代培養(yǎng)超過60天,傳代培養(yǎng)中,貼壁的AHPC克隆內(nèi)細(xì)胞較小,核漿比率大,呈上皮樣細(xì)胞的形態(tài),部分細(xì)胞仍然具有獨(dú)立形成克隆的能力,但觀察發(fā)現(xiàn),AHPC克隆解離為細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行傳代培養(yǎng)中細(xì)胞的增殖比解離為單細(xì)胞傳代好。
　　 結(jié)論

7、：
　　 1.在正常成體小鼠肝臟內(nèi)存在一種肝臟組織特異性的成體肝臟祖細(xì)胞(AHPC),并已成功建立了體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型。
　　 2.小鼠AHPC體外培養(yǎng)活化后可持續(xù)克隆性增殖超過60天,并可連續(xù)傳代培養(yǎng),具有向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化的雙向分化潛能。
　　 3.肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(NPC)的生長可以促進(jìn)AHPC的增殖、成熟和分化。
　　 4.與國外文獻(xiàn)報導(dǎo)的肝臟祖細(xì)胞相比,小鼠AHPC體外培養(yǎng)中細(xì)胞表型不同,具有