智能水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架制備和生物學(xué)性能研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分:基質(zhì)金屬蛋白酶酶解控釋血管內(nèi)皮生長因子聚乙二醇水凝膠制備與鑒定
　　第一節(jié) 四枝化狀丙烯酰化聚乙二醇的合成與鑒定
　　目的:運(yùn)用接枝聚合方法制備四枝化狀丙烯?；垡叶?4branched-PEG-DA),并鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)及屬性是否符合實驗設(shè)計要求。
　　方法:以分子量20,000Da線性聚乙二醇(PEG)單體為原料,通過四步合成方法,在單體末端引入四個丙烯?；p鍵

2、官能團(tuán)。經(jīng)紅外光譜、1H核磁波譜、高效液相色譜、基質(zhì)輔助激光解吸電離及凝膠過濾色譜檢測聚合物產(chǎn)品在分子結(jié)構(gòu)、目標(biāo)官能團(tuán)置換度、終產(chǎn)物產(chǎn)率、分子量及產(chǎn)物純度方面是否符合實驗設(shè)計、滿足后續(xù)實驗要求。
　　結(jié)果:自制4branched-PEG-DA產(chǎn)物經(jīng)紅外光譜、1H核磁共振檢測證實分子結(jié)構(gòu)與設(shè)計相符、末端雙鍵官能團(tuán)置換度96.3％;高效液相色譜檢測顯示產(chǎn)物純度為98.4％;基質(zhì)輔助激光解吸電離檢測提示產(chǎn)物實際平均分子量與設(shè)計結(jié)構(gòu)分子量

3、相符;凝膠過濾色譜檢測結(jié)果顯示產(chǎn)物多分散性數(shù)值為1.02,產(chǎn)物分子量均一,純度較高。
　　結(jié)論:通過接枝聚合方法制備4branched-PEG-DA在分子結(jié)構(gòu)、目標(biāo)官能團(tuán)置換度、終產(chǎn)物產(chǎn)率、分子量及產(chǎn)物純度方面均符合實驗設(shè)計、滿足后續(xù)實驗要求。
　　第二節(jié) 基質(zhì)金屬蛋白酶酶解控釋血管內(nèi)皮生長因子聚乙二醇水凝膠制備及釋藥性能研究
　　目的:制備基質(zhì)金屬蛋白酶酶解控釋血管內(nèi)皮生長因子聚乙二醇水凝膠(VEGF-MMP多肽-P

4、EG gel),觀察其形貌結(jié)構(gòu)并研究酶解控釋效應(yīng),為后續(xù)實驗奠定基礎(chǔ)。
　　方法:運(yùn)用9-芴甲氧羰基(Fmoc)多肽固相法合成含有巰基(-SH)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)底物多肽。利用4branched-PEG-DA與血管內(nèi)皮生長因子-165(vascular endothelial growth factor165,VEGF-165)共價結(jié)合后,根據(jù) Michael加成反應(yīng)原理,

5、與含有巰基的MMP底物多肽結(jié)合生成VEGF載藥聚乙二醇水凝膠(VEGF-MMP多肽-PEG gel)。通過大體形態(tài)及掃描電鏡觀察 VEGF-MMP多肽-PEG gel形貌及微觀結(jié)構(gòu)。運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),研究基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)與VEGF-MMP多肽-PEG gel之間酶解釋藥的關(guān)系。
　　結(jié)果:室溫下 VEGF-MMP多肽-PEG gel

6、大體形態(tài)為透明果凍狀。經(jīng)掃描電鏡觀察,水凝膠表面微觀形態(tài)呈網(wǎng)狀。其中對 MMP敏感的VEGF-MMP多肽-PEG gel(VEGF-MMP(W)X-PEG gel)表面孔隙平均直徑為0.251±0.101um,孔隙率為10.1±1.21％。ELISA檢測結(jié)果顯示,VEGF-MMP多肽-PEG gel對 VEGF-165包封率為84.33±1.18％。凝膠形態(tài)崩解時相及ELISA檢測結(jié)果顯示,在不同濃度 MMP-2作用下,VEGF-MMP

7、(W)X-PEG gel具有穩(wěn)定的VEGF釋放速率。
　　結(jié)論:通過 Michael加成反應(yīng)制備的VEGF-MMP(W)X-PEG gel與 MMP-2具有穩(wěn)定的控釋關(guān)系,滿足后續(xù)實驗要求。
　　第二部分:VEGF控釋水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架制備及體外生物相容性研究
　　第一節(jié) VEGF控釋水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架的制備與鑒定
　　目的:制備 VEGF控釋水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架,并通過形態(tài)學(xué)觀察和免疫熒光染色鑒

8、定是否成功構(gòu)建復(fù)合支架。
　　方法:運(yùn)用生物素(Sulfo-NHS-SS-Biotin)修飾去細(xì)胞瓣支架,行免疫熒光染色鑒定。根據(jù)親和素-生物素結(jié)合原理,將含有生物素的VEGF控釋水凝膠(VEGF-bio-MMP(W)X-PEG gel)與去細(xì)胞瓣支架復(fù)合,行 HE染色和掃描電鏡觀察。
　　結(jié)果:結(jié)合生物素的去細(xì)胞瓣支架,經(jīng)攜帶 Cy3熒光親和素染色,熒光顯微鏡顯示瓣膜基質(zhì)呈紅色。形態(tài)學(xué)觀察顯示,水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架具有

9、去細(xì)胞瓣三層基質(zhì)結(jié)構(gòu)和凝膠規(guī)則網(wǎng)狀孔隙微觀結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論:按實驗設(shè)計成功制備 VEGF控釋水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架。
　　第二節(jié) VEGF控釋水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架體外生物相容性研究
　　目的:參照 GB/T1688國家標(biāo)準(zhǔn),體外研究 VEGF控釋水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架生物相容性。
　　方法:參照 GB/T1688國家標(biāo)準(zhǔn),對復(fù)合支架進(jìn)行血液相互作用實驗,研究其對血小板激活、凝血時間、溶血的影響;對復(fù)合支架

10、及其浸提液進(jìn)行細(xì)胞毒性實驗,研究其對細(xì)胞增殖與凋亡的影響。
　　結(jié)果:經(jīng)掃描電鏡,流式細(xì)胞儀檢測,證實復(fù)合支架可減少去細(xì)胞瓣對血小板的粘附與激活;經(jīng) PT/APTT/INR檢測,證實復(fù)合支架對凝血時間無明顯影響;經(jīng)間接、直接溶血實驗,證實復(fù)合支架溶血率低于 GB/T16886國家標(biāo)準(zhǔn);經(jīng)細(xì)胞增殖、凋亡檢測,證實復(fù)合支架及其浸提液對 MRC-5人胚肺細(xì)胞無明顯影響。
　　結(jié)論:參照 GB/T1688國家標(biāo)準(zhǔn), VEGF控釋水凝

11、膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架具有良好的生物相容性。
　　第三部分:智能水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架制備及體內(nèi)生物學(xué)性能研究
　　第一節(jié) 智能水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架的制備與鑒定
　　目的:制備抗 CD34抗體-VEGF控釋水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架(智能水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架),并通過免疫熒光染色鑒定是否成功構(gòu)建復(fù)合支架
　　方法:運(yùn)用生物素(Sulfo-NHS-SS-Biotin)修飾去細(xì)胞瓣支架。根據(jù)親和素-生物素結(jié)合原

12、理,將 VEGF-bio-MMP(W)X-PEG gel與去細(xì)胞瓣支架復(fù)合。同樣原理,將經(jīng)生物素化抗 CD34抗體與水凝膠-去細(xì)胞瓣支架復(fù)合,行免疫熒光染色鑒定。
　　結(jié)果:結(jié)合抗 CD34抗體水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架,經(jīng) FITC標(biāo)記抗 IgG抗體染色,熒光顯微鏡顯示瓣膜基質(zhì)呈綠色。
　　結(jié)論:按實驗設(shè)計成功制備智能水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架。
　　第二節(jié) 智能水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架體內(nèi)生物學(xué)性能研究
　　目的

13、:建立兔頸動脈瓣膜管道移植模型,評估智能水凝膠-去細(xì)胞瓣復(fù)合支架體內(nèi)生物學(xué)性能.
　　方法:運(yùn)用改良兔頸動脈“Cuff”套管技術(shù),建立兔頸動脈瓣膜管道移植模型。分別于術(shù)后24小時和7天,通過多普勒彩色超聲檢測管道通暢與否,判斷動物模型建立是否成功。術(shù)后24小時,取出移植物,根據(jù)組織形態(tài)學(xué)檢測,評估移植管道對 CD34+細(xì)胞的粘附能力。術(shù)后7天,取出移植物,根據(jù)組織形態(tài)學(xué)檢測及eNOS mRNA定量分析,評估移植管道內(nèi)皮化程度。