控釋細胞因子的膠原凝膠生物支架對神經(jīng)干細胞生物學的影響.pdf

1、中樞神經(jīng)損傷后神經(jīng)元無法再生，損傷平面以下運動，感覺及括約肌功能喪失。現(xiàn)有的治療措施只能延緩脊髓損傷，無法逆轉(zhuǎn)已損傷的神經(jīng)組織。神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)為其治療提供了一個全新的方向。神經(jīng)干細胞具有增殖、自我更新和分化成神經(jīng)細胞的能力，從而替代死亡的神經(jīng)元，重建神經(jīng)通路。但目前單純神經(jīng)干細胞移植由于缺乏細胞外基質(zhì)的支持，其存活率和分化特性嚴重受到影響。而神經(jīng)組織工程技術(shù)治療脊髓損傷是現(xiàn)在研究的一個熱點，本課題組擬通過神經(jīng)球方法原代培養(yǎng)大鼠胚胎神經(jīng)

2、干細胞，并研究神經(jīng)干細胞體外分化特性，利用培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞作為種子細胞和膠原凝膠生物支架一起構(gòu)建神經(jīng)干細胞三維培養(yǎng)模型，并檢測膠原凝膠生物支架與神經(jīng)干細胞的生物相容性，最后構(gòu)建控釋細胞因子的膠原凝膠生物支架，并觀察其對神經(jīng)干細胞的生物學影響。本研究共分為三個部分：
　　在第一部分中，我們利用無血清懸浮培養(yǎng)的方法分離培養(yǎng)大鼠胚胎皮質(zhì)來源的神經(jīng)干細胞，用免疫熒光的方法檢測神經(jīng)干細胞及其分化細胞的標志物。結(jié)果顯示體外無血清培養(yǎng)胎鼠皮質(zhì)神

3、經(jīng)干細胞，可得到懸浮生長的神經(jīng)球，但懸浮生長的神經(jīng)球可以發(fā)生融合，免疫細胞化學顯示神經(jīng)球表達神經(jīng)干細胞標志物巢蛋白，經(jīng)過胎牛血清誘導后，神經(jīng)干細胞可以分化為神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，其中神經(jīng)膠質(zhì)細胞的分化比例最高。
　　在第二部分中我們將神經(jīng)干細胞與膠原凝膠進行三維培養(yǎng)構(gòu)建神經(jīng)干細胞三維培養(yǎng)模型，結(jié)果顯示神經(jīng)干細胞與膠原凝膠具有良好的生物相容性，膠原凝膠三維支架中的神經(jīng)干細胞可以快速增殖并形成神經(jīng)克隆球，這些神經(jīng)克隆球可

4、以被傳代并且重新在懸浮培養(yǎng)體系中形成傳統(tǒng)的神經(jīng)球。膠原凝膠中的神經(jīng)克隆球表達神經(jīng)干細胞的特異性標志物巢蛋白，并且可以分化形成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞。與懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球相比，早期三維培養(yǎng)中形成的神經(jīng)克隆球其分化為神經(jīng)元的潛能更高，且三維培養(yǎng)中神經(jīng)球突起長度明顯長于貼壁分化組中神經(jīng)球的長度。
　　在第三部分中我們首先構(gòu)建控釋細胞因子的膠原凝膠支架，利用ELISA方法檢測生物支架中細胞因子的釋放曲線，結(jié)果顯示膠原凝膠是良好的

5、細胞因子控釋載體支架，細胞因子在體外釋放可達10天，控釋細胞因子的膠原凝膠支架與神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)后，并分為共分為四組：A：復合BDNF-NT-3膠原凝膠組（實驗組）；B：復合 BDNF膠原凝膠組（對照組）；C:復合 NT-3膠原凝膠組（實驗組）D：膠原凝膠組（對照組）。利用 CCK-8檢測各培養(yǎng)組中的細胞活性，結(jié)果顯示復合BDNF-NT-3膠原凝膠組中細胞活力要高于其他實驗組，其中膠原凝膠組的細胞活力最低。隨機選取各組20個神經(jīng)球，同時

6、利用DP71圖像處理軟件計算各組神經(jīng)軸突的長度，結(jié)果顯示復合BDNF-NT-3膠原凝膠組中神經(jīng)突起的長度要長于其他各組。各組神經(jīng)干細胞培養(yǎng)一周后，用1%的FBS誘導分化，結(jié)果顯示各組神經(jīng)干細胞均可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞，復合BDNF-NT-3膠原凝膠組分化的神經(jīng)元比例最高，其中在復合 BDNF-NT-3膠原凝膠組和復合BDNF膠原凝膠組中神經(jīng)干細胞分化比例的順序為神經(jīng)元>神經(jīng)膠質(zhì)細胞>少突膠質(zhì)細胞，在復合NT-3膠原凝

7、膠組和膠原凝膠組中神經(jīng)干細胞分化比例的順序為神經(jīng)膠質(zhì)細胞>神經(jīng)元>少突膠質(zhì)細胞。
　　綜上所述，在無血清含有生長因子的培養(yǎng)條件下，利用神經(jīng)球方法可以分離培養(yǎng)出胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)干細胞，神經(jīng)干細胞具有增殖和多向分化的能力。膠原凝膠與神經(jīng)干細胞具有良好的生物相容性，可以提供神經(jīng)干細胞生長所需要的三維環(huán)境，作為細胞因子控釋的載體，不僅可以保護細胞因子的生物活性，還可以促進神經(jīng)干細胞軸突生長和向神經(jīng)元方向分化，多個細胞因子聯(lián)合應用，其作用更為有