P2X家族受體在白血病中的異常表達及異常功能研究.pdf

1、核苷酸類物質(zhì)是新近闡明的細胞間通訊載體，它們結(jié)合細胞膜上的P2家族嘌呤受體，調(diào)節(jié)細胞的生存和功能。根據(jù)結(jié)構(gòu)的不同P2家族受體可分為P2X和P2Y兩個家族，P2Y為七次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，而P2X家族受體是一種ATP門控的離子通道，具有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域及位于胞內(nèi)的氨基和羧基末端。P2X受體與配體結(jié)合后構(gòu)象改變，實現(xiàn)通道開啟、關(guān)閉和離子的通透。P2X7受體是P2X家族特殊成員之一，其羧基末端最長，與其他P2X家族受體亞型在藥理學性質(zhì)和形成溶

2、胞孔方面有明顯區(qū)別。它對二價陽離子有較強的選擇性，在激動劑ATP或BzATP刺激時離子通道選擇性地開放，對Na+、K+和Ca2+選擇性通透；重復(fù)或者延長刺激，該通道形成大孔，可使熒光黃、溴化乙錠和YO-PRO等大分子通過。
　　 P2X受體廣泛分布于各個組織和細胞，功能呈多樣性，參與各種生理和病理過程。且越來越多的證據(jù)表明P2X受體各亞型之間的共表達共組裝會形成新的功能性通道而發(fā)揮獨特的功能，這需要我們更全面的研究P2X受體家族

3、在任何一種細胞型或任何生理病理過程中的表達狀態(tài)，利于更深入闡明他們所發(fā)揮的功能。P2X受體在血液系統(tǒng)腫瘤中的意義越來越受到關(guān)注，目前多集中于P2X7受體亞型的研究，發(fā)現(xiàn)P2X7受體表達異常與C-LL，AML，ALL，MDS，CML等多種白血病有關(guān)，目前還沒有系統(tǒng)而全面的報道研究P2X受體家族在兒童急性白血病中的表達特點。P2X7的功能受多因素、多環(huán)節(jié)的調(diào)控，隨著對P2X7受體研究的逐漸深入，研究者不斷發(fā)現(xiàn)各種功能異常的P2X7受體。我們

4、在白血病細胞系LCL-H和J6-1中發(fā)現(xiàn)了P2X7受體功能的異常，高表達CD39相關(guān)的ATP酶活性是LCL-H細胞P2X7受體功能異常的原因，而J6-1細胞中有其他因素影響P2X7受體的功能。我們從J6-1中克隆得到的P2X7受體基因在第559位有一個A-G有義突變，導(dǎo)致hsn187-Asp187（N187D），我們試圖從基因水平解釋該突變體功能異常的原因。
　　 根據(jù)以上的國內(nèi)外研究背景及我室以往的研究結(jié)果，本文以P2X受體家

5、族在兒童急性白血病的表達特點及J6-1細胞系來源的突變型P2X7受體（N187D）功能異常為研究重點，深入探討P2X受體家族與白血病的關(guān)系及突變型P2X7受體功能調(diào)控的影響及其在白血病中的意義。本文主要完成了以下研究工作：
　　 1.應(yīng)用realtimeRT-PCR、westernblot和熒光測鈣方法，證明了P2X1，4，5，7受體亞型在兒童急性白血病患者的骨髓單個核細胞中廣泛表達，且其mRNA和蛋白表達水平均顯著高于對照。其

6、中尤為關(guān)注的是相對于初診患者，P2X7受體顯著高表達于復(fù)發(fā)患者中。線性相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)P2X受體亞型之間存在顯著的共表達特征，尤其是P2X4和P2X7之間的共表達。另外，經(jīng)過標準化療達到完全緩解后，除P2X1受體略有降低外P2X4，5，7受體表達水平均顯著降低。提示造血相關(guān)的P2X受體與兒童急性白血病的發(fā)生、發(fā)展和治療密切相關(guān)。
　　 2.在該突變體（N187D）序列基礎(chǔ)上用overlapPCR方法回復(fù)突變得到野生型P2X7，構(gòu)建了

7、野生型及突變型P2X7真核表達載體，并轉(zhuǎn)染不表達P2X7受體的K562細胞，RT-PCR、Westernblot和免疫熒光法證實構(gòu)建成功，獲得了穩(wěn)定表達細胞株（K562-W/K562-M）；體外實驗發(fā)現(xiàn)突變型P2X7受體對激動劑刺激敏感性降低，在常規(guī)濃度激動劑BzATP刺激下不能引發(fā)受體介導(dǎo)的一系列反應(yīng)，而在高濃度的激動劑刺激下增加細胞凋亡率，介導(dǎo)鈣離子內(nèi)流，引起ERK磷酸化水平升高，并且該突變型P2X7受體敏感性降低與細胞表面ATPa

8、se活性無關(guān)；相對于K562-W，K562-M細胞在體外及裸鼠體內(nèi)增殖能力明顯增強，凋亡減少，且共聚焦顯微鏡下顯示K562-M瘤塊中有大量的CD206陽性的Ⅱ型巨噬細胞浸潤和明顯的血管新生，實時定量PCR方法證明K562-M瘤組織中人源和鼠源性促血管新生因子VEGF和人源的單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）表達水平升高，提示血管新生和巨噬細胞在其中發(fā)揮重要的作用。上述結(jié)果提示除了減少的細胞凋亡因素外，突變型P2X7受體N187D在體內(nèi)還

9、通過其他復(fù)雜的機制促進惡性腫瘤的發(fā)展。
　　 綜上所述，本文首次系統(tǒng)而全面的研究了P2X受體家族在兒童急性白血病中的表達特點及其與疾病治療的關(guān)系，首次在血液疾病中發(fā)現(xiàn)了P2X受體亞型之間顯著的共表達特點，為深入闡明P2X受體家族介導(dǎo)的信號傳遞在白血病發(fā)生發(fā)展中的作用機制奠定了基礎(chǔ)；首次確定了一種配體敏感性降低的新P2X7突變類型，區(qū)別于以往報道的無功能型和功能增強型P2X7突變體，該突變體功能異常與惡性腫瘤發(fā)展相關(guān)，為進一步闡明